[发明专利]一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

背景技术

人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs）具有多系分化特性、低免疫原性、来源丰富、易于富集、扩增能力强、不牵涉医学伦理问题等优势，在再生医学中具有广泛的应用前景。业已证明，在适宜诱导条件下hAMSCs可分化成内皮和肝上皮样细胞、心肌细胞样细胞、神经元样细胞、成骨细胞等，但其能否分化为分泌胰岛素的胰腺B细胞迄今未见有关介绍。

Ⅰ型糖尿病的发生与遗传因素、环境因素及免疫机制有关，其根本的病因病机是胰腺B细胞破坏致胰岛素分泌不足。Ⅰ型糖尿病病人必须终生依赖胰岛素治疗才能维持生命。尽管胰腺或胰岛移植移植可望成为治疗Ⅰ型糖尿病的理想方法，但因其组织供源、免疫排异、技术难度等问题而受颇多限制。hAMSCs具有多系分化能力和免疫豁免特性，诱导其分化为胰岛素分泌细胞（insulin secreting cells，ISCs）为治疗Ⅰ型糖尿病提供新的供体细胞无疑具有重要的应用价值。

发明内容

本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的问题，本发明提供一种使hAMSCs分化为ISCs的诱导方法。

本发明采用的技术方案：一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤：

（1）分离hAMSCs：将人羊膜剪成碎片，加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，于37°C，200 转/分旋转消化10分钟，弃上清；重新加入消化液，于37°C，200 转/分旋转消化30分钟，弃上清，留取未消化的羊膜碎片，用D-Hank’s液冲洗二次，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ml的胶原酶，于37°C，200转/分旋转消化约2 h至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，1500 转/分离心10 分钟，收集细胞沉淀即原始hAMSCs；

（2）纯化hAMSCs：将分离的原始hAMSCs重新悬浮于LG-DMEM培养基中（含10% FBS，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1% 非必需氨基酸，55 μmol/L 2-巯基乙醇，1 mmol/L丙酮酸钠，100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素），以1.25×10⁵/ml的细胞密度接种于6孔培养板，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂，的CO₂培养箱培养36～48小时，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞。第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达80~90%后，用0.25%胰蛋白酶—0.02% EDTA溶液于37°C消化2~3 分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分，离心5 分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×10⁷/L的细胞密度传代；

（3）鉴定hAMSCs：取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫组织化学染色，hAMSCs表达波形蛋白而不表达CK19；用流式细胞仪检测CD29、CD44、CD166、 CD34和CD45，hAMSCs的表型特征为为CD29⁺CD44⁺ CD166⁺ CD34^—CD45^—；

（4）诱导hAMSCs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N₂补充物的无血清HG-DMEM培养基；取第2代hAMSCs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×10⁶个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次；

（5）ISCs的鉴定： hAMSCs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（PT-PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子-1（pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1）基因mRNA的表达；hAMSCs经上述诱导培养其诱导培养7天即分化为ISCs。