[发明专利]用电化学发光免疫传感器测定卵巢癌胚抗原的方法

摘要

本发明公开了一种用电化学发光免疫传感器测定卵巢癌胚抗原的方法。利用免疫夹心法制作载有生物活性物质的Fe3O4磁性纳米粒子。将此粒子修饰于固体石蜡碳糊电极(SCPE)表面，研制出易更新的免疫传感器，利用电化学发光方法实现对CA125抗原的测定。GOD催化氧化葡萄糖产生H2O2，并促使Luminol产生电化学发光(ECL)信号。电化学发光信号随GOD标记二抗浓度的增加而显著增强。该传感器对CA125响应良好，其线性范围为0.01-10mU/mL。本发明灵敏度高、选择性好、特异性强、易更新、应用范围广。

主权项

一种用电化学发光免疫传感器测定卵巢癌胚抗原的方法，其特征在于具体步骤为：(1)将玻璃管两端磨平并洗干净，按2～4∶1的比例混合固体石蜡和碳粉，加热至石蜡熔化，搅拌均匀，在玻璃管的一端插入铁棒后，从玻璃管的另一端装入上述混合后的石蜡碳糊，冷却后在光滑打印纸并在麂皮上依次用1.0～0.05μm的Al2O3粉抛光电极表面；使用前分别用体积百分比为1∶1的硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，并在1mol/L H2SO4溶液中于‑1.2～1.2V扫描范围内采用循环伏安法进行活化；(2)用化学共沉淀法合成Fe3O4磁性纳米粒子：按照Fe2+与Fe3+物质量比为1～1.5∶2配成反应液；调节恒温水浴至50℃，搅拌，加入2mol/LNaOH至pH9.5～12，保持pH不变，反应1～2小时；然后逐渐升温至80℃，加热熟化0.8～1.5小时；整个反应在氮气保护下进行；得到的黑色悬浮液超声后用磁铁分离，用二次蒸馏水洗涤至中性；75℃下真空干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子；(3)称取45～55mg步骤(2)制得的Fe3O4磁性纳米粒子分散于15～25mL无水乙醇中，超声振荡；搅拌下加入0.1～0.3mL质量百分比浓度为98％的3‑氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应10～15小时，制得氨基化的Fe3O4磁性纳米粒子，用无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗后定容至10～30mL；(4)在5～15mL步骤(3)制得的溶液中加入1～3mL体积百分比浓度为10％的戊二醛，搅拌2～5小时后，用磁铁分离，清洗；再次分散悬浮在1～3mL pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，然后加入50μL浓度为1.0mg/mL的卵巢癌胚抗原抗体溶液，4℃下轻轻搅拌12小时，用磁铁分离，用含0.1mol/L NaCl和体积百分比浓度为0.05％的Tween 20的磷酸盐缓冲液彻底清洗后，分散于2mL磷酸盐缓冲液中；(5)用磁铁吸住步骤(1)制得的固体石蜡碳糊电极铁棒外端，微量移液器移取10μL步骤(4)制备的固定有卵巢癌胚抗原抗体的磁性粒子滴涂在电极表面，使之均匀覆盖；将电极置于质量百分比浓度为1％牛血清白蛋白溶液中30分钟，以封闭非特异性吸附位点，用磷酸盐缓冲液清洗；晾干后置于含8.0μU/mL～10mU/mL卵巢癌胚抗原抗体溶液的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟；然后再置于含15μL浓度为5μg/mL葡萄糖氧化酶标记卵巢癌胚抗原抗体的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟，用磷酸盐缓冲液清洗电极；(6)检测方法：室温下，将摩尔浓度为1mol/L的葡萄糖、摩尔浓度为0.6 mmol/L的鲁米诺和浓度为0.05mol/L，pH为8.5的Tris‑HCl配制于10mL石英烧杯中，然后选用电致化学发光分析系统，采用三电极系统进行测试，测量ECL的强度；扫描范围为‑0.3～0.6V(vs.SCE)，扫速为100mV/s；光电倍增管高压为600V，采样速率为10T/S，放大倍数为4，测量时间为90s；(7)标准工作曲线的绘制：用磁铁吸住步骤(1)制得固体石蜡碳糊电极的铁棒上端，微量移液器移取10μL上述制备的固定有卵巢癌胚抗原抗体的磁性粒子滴涂在电极表面，使之均匀覆盖；将电极置于质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白溶液中30分钟以封闭非特异性吸附位点，用磷酸盐缓冲液清洗；晾干后置于含卵巢癌胚抗原抗体溶液的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟；然后再置于含15μL浓度为5μg/mL的葡萄糖氧化酶标记卵巢癌胚抗原抗体溶液的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟，用磷酸盐缓冲液清洗除去未键和的酶标二抗分子；卵巢癌胚抗原在0.01‑10mU/mL浓度范围内与ECL信号成线性关系：I＝94.87C+144.65，C的单位为mU/mL，相关系数R＝0.9987；由此式计算出卵巢癌胚抗原的浓度；(8)实际检测应用：取人血清样品进行检测，并采用标准曲线法进行加标回收实验；检测前血清样品经逐级稀释；用磁铁吸住步骤(1)制得固体石蜡碳糊电极的铁棒上端，微量移液器移取10μL上述制备的固定有卵巢癌胚抗原抗体的磁性粒子滴涂在电极表面，使之均匀覆盖；将电极置于质量百分比浓度为1％的牛血清白蛋白溶液中30分钟以封闭非特异性吸附位点，用磷酸盐缓冲液清洗；晾干后置于含卵巢癌胚抗原的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟；然后再置于含15μL浓度为5μg/mL的葡萄糖氧化酶标记卵巢癌胚抗原抗体的磷酸盐缓冲液中孵化30分钟，用磷酸盐缓冲液清洗除去未键和的葡萄糖氧化酶标记卵巢癌胚抗原抗体；然后选用电致化学发光分析系统，采用三电极系统进行测试，并测定ECL的强度，根据I＝94.87C+144.65，C的单位为mU/mL，计算出卵巢癌胚抗原的浓度。