[发明专利]用电化学发光免疫传感器测定卵巢癌胚抗原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用电化学发光免疫传感器测定卵巢癌胚抗原的方法。

背景技术

磁性纳米粒子生物相容性好，可用于生物分子的固定；比表面积大，能提高检测的灵敏度。磁性纳米粒子-免疫传感器则将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合了起来。磁性纳米粒子敏感膜电化学传感器通常以伏安法或电位法进行检测。电化学发光(ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个过程。ECL检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快。将磁性纳米粒子结合免疫分析，用于制作磁性纳米粒子电化学发光免疫传感器，通过进行电化学发光检测，不但可以大大地提高检测的灵敏度，而且能提高免疫试剂在电极表面的固定量，提高免疫反应活性，能够为生物活性分子的灵敏检测提供良好的分析器件和分析新方法。CA125是一种高分子糖蛋白，在卵巢癌、肺癌、胃癌术前诊断和病情监测中意义重大。血清CA125检测多采用放射免疫分析法、ELISA法、微粒子酶免分析法(MEIA)、化学发光免疫法。传统的检测方法灵敏度较低，因此研究酶放大技术和磁性纳米粒子相结合的电化学发光检测CA125抗原的方法具有重要意义。结合磁性纳米粒子制作的CA125电化学发光免疫传感器未见报道。

发明内容

本发明的目的在于制作一种磁性纳米粒子电化学发光免疫传感器，并且对卵巢癌胚抗原(CA125)进行测定的方法。

构思如下：在Fe3O4磁性复合纳米粒子上标记葡萄糖氧化酶(GOD)，可催化氧化葡萄糖生成过氧化氢，并促使溶液中的Luminol产生电化学发光(ECL)信号。随着GOD浓度的增大，电化学发光信号显著增强，在一定范围内可以用来检测CA125抗原的浓度。

本发明涉及磁性纳米粒子电化学发光免疫分析技术。当抗原浓度改变时，GOD标记二抗的浓度随之改变，Luminol电化学发光强度发生变化，ECL信号与CA125浓度在0.01-10mU/mL范围内成线性关系。

具体步骤如下：

(1)将玻璃管两端磨平并洗干净，按2～4∶1的比例混合固体石蜡和碳粉，加热至石蜡熔化，搅拌均匀，在玻璃管的一端插入铁棒后，从玻璃管的另一端装入上述混合后的石蜡碳糊，冷却后在光滑打印纸并在麂皮上依次用1.0～0.05μm的Al₂O₃粉抛光电极表面；使用前分别用体积百分比为1∶1的硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，并在1mol/L H₂SO₄溶液中于-1.2～1.2V扫描范围内采用循环伏安法进行活化；

(2)用化学共沉淀法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子：按照Fe²⁺与Fe³⁺物质量比为1～1.5∶2配成反应液；调节恒温水浴至50℃，搅拌，加入浓度为2mol/L的NaOH至pH 9.5～12，保持pH不变，反应1～2小时；然后逐渐升温至80℃，加热熟化0.8～1.5小时；整个反应在氮气保护下进行；得到的黑色悬浮液超声后用磁铁分离，用二次蒸馏水洗涤至中性；75℃下真空干燥，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子；

(3)称取45～55mg步骤(2)制得的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散于15～25mL无水乙醇中，超声振荡；搅拌下加入0.1～0.3mL质量百分比浓度为98％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌反应10～15小时，制得氨基化的Fe₃O₄磁性纳米粒子，用无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗后定容至10～30mL；

(4)在5～15mL步骤(3)制得的溶液中加入1～3mL体积百分比浓度为10％的戊二醛，搅拌2～5小时后，用磁铁分离，清洗；再次分散悬浮在1～3mL pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后加入50μL浓度为1.0mg/mL的卵巢癌胚抗原抗体(anti-CA125)溶液，4℃下轻轻搅拌12小时，用磁铁分离，用含浓度为0.1mol/L的NaCl和体积百分比浓度为0.05％的Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)彻底清洗后，分散于2mL磷酸盐缓冲液(PBS)中；