[发明专利]腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法

摘要

本发明公开了腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法，通过腐败希瓦氏菌抗体溶液制备，再与磁珠制备成免疫磁珠，可以对含有腐败希瓦氏菌的样品进行细菌富集，使得腐败希瓦氏菌浓缩、纯净，然后进行煮沸分解得到模板DNA溶液，与由含有荧光染料的TaqTMII混合液、FQR引物溶液和FQF引物溶液反应体系中进行PCR反应，根据PCR反应中的荧光信号有无响应，判断待检样品溶液是否含有腐败希瓦氏菌，该反应是对腐败希瓦氏菌特异性引物进行的FQ-PCR荧光反应，检测简便，灵敏，定性检测时间较低短，检测效率高，因此本发明是一种检测时间较低短、检测效率和灵敏度较高的腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法。

主权项

腐败希瓦氏菌的免疫磁珠‑FQ‑PCR检测方法，其特征在于包括下述步骤：1）、抗体制备：将浓度为109cfu/mL的腐败希瓦氏菌液0.20mL注射于小鼠腹腔内首次免疫，间隔一周相同剂量的腐败希瓦氏菌液加强免疫一次，共加强免疫三次，每次加强免疫的腐败希瓦氏菌液浓度为1010cfu /mL，最后一次加强免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37℃下温育0.5h，4℃下3000 r / min离心15min，取上清，得到腐败希瓦氏菌抗体溶液； 2）、免疫磁珠制备：取48mg的Fe3O4 磁株先后用乙醇和双蒸水超声清洗干净，用二次水定容至20mL得磁珠溶液，在10mL磁株溶液中，加入质量浓度为10%戊二醛溶液2mL，室温下搅拌3h，固液分离后用磷酸吐温缓冲液清洗磁株，所述磷酸吐温缓冲液中由磷酸缓冲液与吐温20配制而成，所述磷酸吐温缓冲液中所述吐温20的体积百分浓度为0.03～0.07%，再将清洗后的磁株悬浮于2mL磷酸缓冲液中，所述磷酸缓冲液的pH为7～7.5，然后加入50μL上述腐败希瓦氏菌抗体溶液，4℃下轻轻搅拌12h，得到腐败希瓦氏菌免疫磁珠溶液，4℃保存备用； 3）、待测样品富集：在盛有0.1mL的上述腐败希瓦氏菌免疫磁珠溶液中加入1mL待测样品液，室温下轻缓旋转振荡30min，将试管置于磁性细胞分离架上3min，移出管中液体，每次用1.0mL上述磷酸缓冲液清洗腐败希瓦氏菌免疫磁珠，重复清洗3～5次，清洗完毕，加入0.5～1mL无菌水，磁性分离，取出腐败希瓦氏菌免疫磁珠后，得到富集的待检样品溶液；4）、模板DNA制备：将上述待检样品溶液，在100℃温度下煮沸10min，12000 r / min离心5min，取上清，得到模板DNA溶液；5）、PCR反应：取上述模板DNA溶液5μL，加入到由含有荧光染料的TaqTM II混合液10μL、引物浓度为10μM的FQF引物溶液0.5μL、引物浓度为10μM的FQR引物溶液0.5μL的反应体系中，用无菌水无菌水定容至20μL，反应程序：95℃预变性5min；94℃变性5s、50℃退火15s、72℃延伸15s，共45个循环；PCR反应中若有荧光信号响应，待检样品溶液含有腐败希瓦氏菌；所述FQF引物溶液含有序列为GTGAAACTCA TTTGGGTTGT AT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列为CCGTTCGGAA ATCGTTAG的特有性引物。