[发明专利]一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用，将带有活性基团的联吡啶钌修饰到金纳米粒子表面形成电化学发光纳米粒子探针，对电化学发光起放大作用，在工作电极表面上修饰上部分DNA单链，组成电化学发光传感器。将目标分析物凝血酶与部分DNA双链作用，再与DNA聚合酶和Nb.BbvCI切口酶、部分DNA单链作用，得DNA杂交液，将其加到传感器中，使得电极表面电化学发光纳米粒子探针增加，导致电化学发光信号增强，以此现象实现对凝血酶的测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。

主权项

一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）将金电极浸入0.5×10‑7～1.5×10‑7 M的DNA1中，37℃固定4 h后，在金电极表面形成自组装膜，用PBS溶液冲洗，再用0.5×10‑3～1.5×10‑3 M 的巯基己醇封板，用PBS溶液冲洗金电极；（2）取DNA杂交液于小样品管中，37℃浸泡金电极进行杂交，之后用PBS冲洗金电极；（3）取发光探针溶液于小样品管中，将金电极插入其中在37℃下浸泡进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗金电极，从而制得电化学发光生物传感器；其中：所述的DNA杂交液按如下方法制备而成：在小样品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下杂交后，向其中加入凝血酶，室温下反应后再加入DNA3，37℃下反应后加入Tris‑HCl缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶Phi 29，37℃反应；然后加入Tris‑HCl缓冲液、DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应，即得；所述的发光探针溶液按如下方法制备而成：在小样品管中加入依次加入pH为8.2的Tris‑HCl、TCEP、DNA4、巯基乙胺，室温放置20‑60min后加入金纳米粒子，室温下反应10‑14 h后加入pH为9.0的硼酸缓冲液，取活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜，将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心，弃去上清液，加入Tris‑HCl缓冲液洗涤后定容，即得；所述的DNA1的部分序列为5`‑CCAACCACACCAACCCAC‑3`；所述的DNA2的部分序列为3`‑GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC‑5`；所述的DNA3的部分序列为3`‑ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT‑5`；所述的DNA4的部分序列为3`‑SH‑CAGACTCCAACT‑5`。