[发明专利]一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用

说明书

技术领域

    本发明属于分析化学与电化学发光传感器领域，具体为一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用。另外，本发明还涉及采用所述的电化学发光传感器检测凝血酶的方法。

 

背景技术

    凝血酶（Thombin）作为一种重要的蛋白酶，在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥着重要作用。由于恶性肿瘤患者常有不同程度的出血倾向，肿瘤组织对周围组织侵袭、肿瘤细胞转移以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化，均可改变患者的凝血机制。衡量凝血机制的重要指标之一就是检测凝血酶的浓度，这为揭示肿瘤的发生机制，以及作为临床早期诊断、疗效及预后判断具有重大意义。

    目前测定凝血酶的传统方法主要有荧光法和发色底物法，其灵敏度不高，不满足实际检测要求。适体是利用指数富集配基的系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）技术筛选出来的。能够与目标蛋白等进行高亲合性、高特异性的结合，其特异性可与抗原抗体相媲美。同时适体稳定、便宜、易合成、可再生，因而近年来成为蛋白分析的有力工具之一。目前利用适体的识别进行凝血酶检测方法主要为二茂铁淬灭钌联吡啶电化学发光等方法[Yan Li, Honglan Qi, Yage Peng, Qiang Gao, Chengxiao Zhang. Electrochem.Commun., 2008, 10, 1322-1325; Hongying Zhu, Jonathan D. Suter, Ian M. White, Xudong Fan. Sensors 2006, 6(8), 785-795; Anna Pasternak, Frank J. Hernandez, Lars M. Rasmussen, Birte Vester, Jesper Wengel. Nucl. Acids Res. 2011, 39(3), 1155-1164]。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对凝血酶的检测要求，但方法的灵敏度不高。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。

 

发明内容

    鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用，以及提供一种采用所述的电化学发光传感器检测凝血酶的方法。

                                 

本发明的目的是这样实现的：                                              

一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）将金电极浸入0.5×10^-7～1.5×10^-7 M的DNA1中，37℃固定4 h后，在金电极表面形成自组装膜，用PBS溶液冲洗，再用0.5×10^-3～1.5×10^-3 M 的巯基己醇封板，用PBS溶液冲洗金电极；

（2）取DNA杂交液于小样品管中，37℃浸泡金电极进行杂交，之后用PBS冲洗金电极；

（3）取发光探针溶液于小样品管中，将金电极插入其中在37℃浸泡进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗金电极，从而制得电化学发光生物传感器；

其中：所述的DNA杂交液按如下方法制备而成：在小样品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下杂交后，向其中加入凝血酶，室温下反应后再加入DNA3，37℃下反应后加入Tris-HCl缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶Phi 29，37℃反应；然后加入Tris-HCl缓冲液、DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应，即得；

所述的发光探针溶液按如下方法制备而成：在小样品管中加入依次加入pH为8.2的Tris-HCl、TCEP、DNA4、巯基乙胺，室温放置20-60min后加入金纳米粒子，室温下反应10-14 h后加入pH为9.0的硼酸缓冲液，取活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜，将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心，弃去上清液，加入Tris-HCl缓冲液洗涤后定容，即得；

所述的DNA1的部分序列为5`-CCAACCACACCAACCCAC-3`；

所述的DNA2的部分序列为3`-GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5`；

所述的DNA3的部分序列为：