[发明专利]一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）将金电极浸入0.5×10^-7～1.5×10^-7 M的DNA1中，37℃固定4 h后，在金电极表面形成自组装膜，用PBS溶液冲洗，再用0.5×10^-3～1.5×10^-3 M 的巯基己醇封板，用PBS溶液冲洗金电极；

（2）取DNA杂交液于小样品管中，37℃浸泡金电极进行杂交，之后用PBS冲洗金电极；

（3）取发光探针溶液于小样品管中，将金电极插入其中在37℃下浸泡进行再杂交，然后用PBS 缓冲液冲洗金电极，从而制得电化学发光生物传感器；

其中：所述的DNA杂交液按如下方法制备而成：在小样品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下杂交后，向其中加入凝血酶，室温下反应后再加入DNA3，37℃下反应后加入Tris-HCl缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶Phi 29，37℃反应；然后加入Tris-HCl缓冲液、DNA 剪切酶Nb.BbvCI，37℃条件下反应，即得；

所述的发光探针溶液按如下方法制备而成：在小样品管中加入依次加入pH为8.2的Tris-HCl、TCEP、DNA4、巯基乙胺，室温放置20-60min后加入金纳米粒子，室温下反应10-14 h后加入pH为9.0的硼酸缓冲液，取活化的联吡啶钌，室温下震荡反应过夜，将溶液于4 ℃，10000 r/min下离心，弃去上清液，加入Tris-HCl缓冲液洗涤后定容，即得；

所述的DNA1的部分序列为5`-CCAACCACACCAACCCAC-3`；

所述的DNA2的部分序列为3`-GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5`；

所述的DNA3的部分序列为3`-ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT-5`；

所述的DNA4的部分序列为3`-SH-CAGACTCCAACT-5`。

2.根据权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述的金纳米粒子按如下方法制备而成：在圆底烧瓶中加入100 mL、0.01%的HAuCl₄，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL、1%的Na₃C₆H₅O₇，再加热、搅拌10分钟，冷却至室温，即得。

3.根据权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述的活化的联吡啶钌按如下方法制备而成：

（1）在100 mL圆底烧瓶中分别加入0.3992 g RuCl₃·xH₂O和0.6324 g 2,2-联吡啶，再加40 mL乙二醇加热回流6 h后，冷却至室温，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽滤，用无水乙醇冲洗三次，得到氯化二联吡啶钌；

（2）取0.16 g 氯化二联吡啶钌，以及0.16 g NaHCO₃，0.12 g 4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(V_甲醇/水=4:1)，将混合液转移到50 mL三口烧瓶中加热回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物调节pH至4.4，抽滤混合物后，再用甲醇冲洗三次，然后取2.0 g NaPF₆溶于14 mL水中，加入到上述滤液中，反应生成沉淀，过滤并干燥沉淀，得到二联吡啶-4,4’-二羧基-2,2’-联吡啶合钌(II)六氟磷酸盐；

（3）在10 mL小烧杯中加入1.0 mL含0.1532 g上述产物的DMF 溶液，再加入1.5 mL含0.23 g EDC和0.119 g NHS 的DMF溶液，搅拌反应 5 h后即得到活后的联吡啶钌。

4.根据权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述的金电极按如下方法预处理：金电极经α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干；采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3[Fe(CN)6]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安扫描，测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。