[发明专利]乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法

摘要

本发明涉及乳糖化羧甲基壳聚糖Fe3O4纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是：步骤一：采用传统共沉淀法利用化学式Fe2++2Fe3++8OH-→Fe3O4+4H2O制备Fe3O4纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法；步骤二：采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基壳聚糖包覆于磁性粒子表面，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(CMCTS-Fe3O4NP)；步骤三：以乳糖为乳糖化试剂，借助CMCTS分子上的游离氨基作交联基团，通过还原氨化法偶联上乳糖中的去唾液酸半乳糖配体，制备同时具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修饰的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(Gal-CMCTS-Fe3O4NP)。

主权项

乳糖化羧甲基壳聚糖Fe3O4纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是：步骤一：采用传统共沉淀法利用化学式Fe2++2Fe3++8OH‑→Fe3O4+4H2O制备Fe3O4纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法，先将高分子物质溶解，然后依次加入Fe2+和H2O2或Fe2+和Fe3+，搅拌的同时滴加碱性溶液，通过氧化沉淀或共沉淀反应，这样磁性物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球：①取1.7ml浓盐酸加二次蒸馏水定容到50ml，称取10.8g FeCl3和4g FeCl2加入其中配成溶液，在配制过程中向溶液中不断通氮气去氧，以减少氧对溶液中离子成分的影响，应用0.22μm滤菌器过滤除菌后取25ml备用，②称取15gNaOH，加二次蒸馏水配制成250ml溶液，倒入三口烧瓶中，三口烧瓶的三个口分别通氮气、接冷凝管、接温度计，再将上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮气保护下，将烧瓶置于利用DF‑101S型集热式恒温磁力搅拌器中，保持80℃反应1h，使所得Fe3O4微粒充分熟化，反应1h结束后持续搅拌至冷却，集热式恒温磁力搅拌器是指被加热容器完全处于强烈的热辐射之中，加热速度是其它平面加热磁力搅拌器的三倍，温度均匀、效率高，更适应球型烧瓶进行加热反应，③上步所得黑色液体倒入1L烧杯，底部放置永磁体，加入二次蒸馏水，待在磁场中黑色物质完全沉淀后弃上层较澄清液，反复用二次蒸馏水冲洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予测pH值约8时，考虑制得的Fe3O4中性，排除了所加酸碱的影响，④所得产物利用冷冻干燥机真空冷冻干燥保存备用；步骤二：采用共混包埋法将具有良好水溶性和生物相容性的羧甲基壳聚糖包覆于磁性粒子表面，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(CMCTS‑Fe3O4NP)，共混包埋法是指将磁性超微颗粒均匀地分散在亲水性高分子水溶液中，主要是通过范德华力、氢键、配位键和共价键等作用将水溶性的高分子物质缠绕在无机磁性颗粒表面，形成聚合物包被的核‑壳式磁性高分子微球：①称取制备冻干的140mg Fe3O4纳米粒子溶于40ml二次蒸馏水后，通氮气去氧，利用超声波清洗机的超声在65℃将磁性粒子分散均匀，以构建下步和羧甲基壳聚糖的反应环境，②称取280mg羧甲基壳聚糖(CMCTS)于20ml二次蒸馏水溶匀，快速倒入上步液体中，继续通氮气去氧，超声下65℃反应1h，③将最后得到的黑色液体利用外加磁场沉淀，弃除上层清液以除外未包覆的杂质后，再加入二次蒸馏水定容至60ml，溶匀即成CMCTS‑Fe3O4NP胶体液，密封4℃保存备；步骤三：以乳糖为乳糖化试剂，借助CMCTS分子上的游离氨基作交联基团，通过还原氨化法偶联上乳糖中的去唾液酸半乳糖配体，制备同时具有磁靶向和肝靶向性的乳糖修饰的羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物(Gal‑CMCTS‑Fe3O4NP)：①将制备的60ml CMCTS‑Fe3O4NP胶体液利用超声37℃分散均匀，②称取336mg乳糖和168mg氰基硼氢化钠慢慢加入上步液体中，利用超声在37℃搅拌反应1h，③将最后得到的黑色液体利用凝胶的分子筛特性，经葡聚糖凝胶SephedaxG‑25柱层析分离，选择0.1mol/L碳酸氢铵溶液洗脱，收集洗脱部分即为较纯化的(Gal‑CMCTS‑Fe3O4NP)胶体液，真空冰冻干燥保存备用。