[发明专利]乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法。

背景技术

随着纳米技术的发展，以纳米颗粒为基因转移载体的研究引起了广泛关注。纳米颗粒是一种粒径在1-100nm之间的超微颗粒，具有表面效应及小尺寸效应。因此，以纳米颗粒作为基因转移载体，有其独特优势，如装载量大、靶向性、可控缓释及生物相容性等。将基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，通过细胞摄粒作用进入细胞内，释放基因治疗分子，发挥基因治疗效能。研究发现，直径在100nm以下的纳米微球，具有很好的细胞摄入效果无论体内还是体外，纳米运载体系均能有效的保护核苷酸，防止其降解，有助于核苷酸转染细胞，并可起到定位作用。因此，纳米颗粒作为基因运载体，不仅增加了核苷酸进入细胞内的量，提高了转染效率，而且也增强了核苷酸在细胞内的稳定性，保证了治疗效应的持久发挥。然而，要制备理想的纳米基因载体，材料的选择十分重要。作为基因载体的纳米材料，必须具备生物相容性强、可降解、易于从体内排泄、本身及其降解产物对人体无毒等特点。

目前已有多种纳米颗粒用作基因转移载体。壳聚糖是近年来发现的一个多聚阳离子型DNA载体，并在体内外得到了越来越广泛的应用，已显示出其巨大的携基因能力。壳聚糖磁性纳米粒以及壳聚糖半乳糖纳米粒作为基因载体已有报道，分别利用了磁性及特异性配体加强其作为载体的靶向能力。我们之前已成功制备羧甲基壳聚糖(CMCS)及磁性Fe₃O₄纳米粒子，基于上述原因，我们选用CMCS及磁性Fe₃O₄为材料，设计了CMCS-Fe3O4磁性复合纳米粒，并借助CMCS分子上的游离氨基作为交联基团，通过还原氨化法偶联上半乳糖配体，制备成CMCS-半乳糖-Fe₃O₄磁性复合纳米粒(Gal-CMCS-Fe₃O₄NP)。以期利用CMCS良好的生物相容性和生物可降解性以及半乳糖对肝细胞的特异靶向性和Fe₃O₄的磁靶向能力，制备出一种新型、高效、靶向性的基因载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种乳糖化羧甲基壳聚糖磁性纳米粒基因载体的制备方法，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是分三步完成，其特征是：

步骤一：采用传统共沉淀法利用化学式Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O制备Fe₃O₄纳米粒子，传统共沉淀法是在生成磁性物质的同时产生磁性高分子微球的制备方法。先将高分子物质溶解，然后依次加入Fe²⁺和H₂O₂或Fe²⁺和Fe³⁺，搅拌的同时滴加碱性溶液，通过氧化沉淀或共沉淀反应，这样磁性物质一产生就被包裹形成核壳磁性高分子微球。①取1.7ml浓盐酸加二次蒸馏水定容到50ml，称取10.8g FeCl₃和4g FeCl₂加入其中配成溶液，在配制过程中向溶液中不断通氮气去氧，以减少氧对溶液中离子成分的影响。应用0.22μm滤菌器过滤除菌后取25ml备用。②称取15gNaOH，加二次蒸馏水配制成250ml溶液，倒入三口烧瓶中，三口烧瓶的三个口分别通氮气、接冷凝管、接温度计，再将上步所得25ml溶液快速加入，在通入氮气保护下，将烧瓶置于利用DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器中，保持80℃反应1h，使所得Fe₃O₄微粒充分熟化。反应1h结束后持续搅拌至冷却，集热式恒温磁力搅拌器是指被加热容器完全处于强烈的热辐射之中，加热速度是其它平面加热磁力搅拌器的三倍。温度均匀、效率高，更适应球型烧瓶进行加热反应。③上步所得黑色液体倒入1L烧杯，底部放置永磁体，加入二次蒸馏水。待在磁场中黑色物质完全沉淀后弃上层较澄清液，反复用二次蒸馏水冲洗黑色沉淀物4次，已不易沉淀，且予测pH值约8时，考虑制得的Fe₃O₄中性，排除了所加酸碱的影响。④所得产物利用冷冻干燥机真空冷冻干燥保存备用(经试验论证，冻干较之于电热鼓风干燥更易制得颗粒状产物，烘干产物易结团成块)。