[发明专利]钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法及其治疗肾脏缺血再灌注损伤中的药物作用

摘要

本发明公开了钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法及其治疗肾脏缺血再灌注损伤中的药物作用，缺血再灌注损伤是移植器官早期无功能及长期存活的主要因素，目前防治肾缺血再灌注损伤的措施虽功不可没，但急需改进，本发明通过大鼠钠钾ATP酶DR区特异性抗体的制备以及纯化，并控制相关参数，提供了钠钾ATP酶DR区特异性抗体的具体的生产与制备方法与储藏方法，验证了其药用成份的作用；在充分认识不同脏器生理差别的基础上，明确钠钾ATP酶DR区特异性抗体(r-DRSAb)对肾缺血再灌注损伤的保护，大胆突破不同脏器细胞的不同的界限，取得了意想不到的技术效果，解决了人们长期以来期望解决，但是没有解决的技术问题。

主权项

钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：包含钠钾ATP酶DR区特异性抗体的制备与钠钾ATP酶DR区特异性抗体的纯化两个步骤：以单只大鼠为单位(1)钠钾ATP酶DR区特异性抗体的制备：A.初步免疫乳剂配置：将人工合成的钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)耦合的DR区多肽100μL(1μg/μL)加100μL弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant，FCA)充分混匀成乳剂(200μL)；B.初步免疫：分别于大鼠背部靠后左右两个部位皮下注射免疫；C.加强免疫乳剂的配置：随后加强免疫为50μL(0.5μg/μL‑1μg/μL)的KLH耦合的DR区多肽免疫加弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant，FIA)充分混匀成乳剂(200μL)；D.加强免疫：进行三次以上的加强免疫，每隔7天免疫注射一次，免疫部位同上；E.检测：ELISA方法检测抗体滴度，达到1∶10000后进行步骤F，未达到的话继续步骤D。F.保存备用：‑80℃‑10℃的环境下进行保存，以备提纯；(2)钠钾ATP酶DR区特异性抗体的纯化：a采用蛋白L(Protein L)抗体结合柱纯化DR区特异性多抗，用磷酸盐缓冲液以2∶1比例(v/v)稀释免疫血清；b加入平衡好的Protein L抗体结合柱纯化25‑45min，经过洗涤后，用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱，迅速调节洗脱蛋白浓度至pH 8.0，过滤灭菌后浓缩，‑80℃‑20℃保存备用。