[发明专利]钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法及其治疗肾脏缺血再灌注损伤中的药物作用

权利要求书

1.钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：包含钠钾ATP酶DR区特异性抗体的制备与钠钾ATP酶DR区特异性抗体的纯化两个步骤：以单只大鼠为单位

(1)钠钾ATP酶DR区特异性抗体的制备：

A.初步免疫乳剂配置：将人工合成的钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)耦合的DR区多肽100μL(1μg/μL)加100μL弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant，FCA)充分混匀成乳剂(200μL)；

B.初步免疫：分别于大鼠背部靠后左右两个部位皮下注射免疫；

C.加强免疫乳剂的配置：随后加强免疫为50μL(0.5μg/μL-1μg/μL)的KLH耦合的DR区多肽免疫加弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant，FIA)充分混匀成乳剂(200μL)；

D.加强免疫：进行三次以上的加强免疫，每隔7天免疫注射一次，免疫部位同上；

E.检测：ELISA方法检测抗体滴度，达到1∶10000后进行步骤F，未达到的话继续步骤D。

F.保存备用：-80℃-10℃的环境下进行保存，以备提纯；

(2)钠钾ATP酶DR区特异性抗体的纯化：

a采用蛋白L(Protein L)抗体结合柱纯化DR区特异性多抗，用磷酸盐缓冲液以2∶1比例(v/v)稀释免疫血清；

b加入平衡好的Protein L抗体结合柱纯化25-45min，经过洗涤后，用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱，迅速调节洗脱蛋白浓度至pH 8.0，过滤灭菌后浓缩，-80℃-20℃保存备用。

2.如权利要求1所述的钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中C中50μLKLH耦合的DR区多肽免疫优选1μg/μL。

3.如权利要求1所述的钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中F中保存温度优选-80℃。

4.如权利要求1所述的钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中步骤B和D中所述的注射方式采用单边注射、左右均量注射或者左右不均量注射。

5.如权利要求1所述的钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中步骤b中纯化时间为30min。

6.如权利要求1所述的钠钾ATP酶DR区特异性抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中步骤b中保存备用的时间为-80℃。

7.如权利要求1-6任一所述的方法制造的钠钾ATP酶DR区特异性抗体在制备治疗肾脏缺血再灌注损伤的药物中的作用。