[发明专利]一种分离检测AFP亚型的新方法

摘要

本发明应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术定性检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型（HS-AFP）。包括以下组份：聚丙烯酰胺溶液；分离胶缓冲液；浓缩胶缓冲液；过硫酸铵溶液；上样缓冲液；阳极电泳缓冲液；阴极电泳缓冲液；蛋白印迹（转移）缓冲液；显色液；一抗（兔抗人AFPIgG）；二抗（HRP-羊抗兔IgG）；磷酸盐缓冲液（0.01MPBS）；硝酸纤维膜。其检测步骤包括：（1）制胶：自上而下2个浓度梯度分别为88.0g/L和50.0g/L；（2）加样电泳；（3）转移；（4）包被；（5）抗原抗体反应；（6）显色，肉眼观察AFP区带分布情况。

主权项

聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型其特征在于包括以下组份：（1）聚丙烯酰胺溶液：准确称取29.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入去离子水6 0ml，加热并搅拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去离子水冲洗烧杯数次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，过滤备用，冷藏保存；（2）分离胶缓冲液：准确称取Tris 18.10 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 8.30，去离子水定容至100 ml，冷藏保存；（3）浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.0 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 6.80，去离子水定容至100毫升，冷藏保存；（4）过硫酸铵溶液：准确称取0.14 g过硫酸铵，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml搅拌溶解，避光冷藏保存； （5）上样缓冲液：1.0 M Tris‑HCl缓冲液(pH6.8)3.1 ml，5.0 ml甘油，1.0 g/L溴酚蓝0.5 ml，加去离子水至10 ml，冷藏保存；（6）阳极电泳缓冲液：准确称取Tris 37.85g，吸取浓盐酸20.8 ml，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；（7）阴极电泳缓冲液：准确称取Tris 22.8 g，硼酸45.0g，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；（8）蛋白印迹（转移）缓冲液：准确称取甘氨酸2.90 g，Tris 5.80 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml，搅拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml无水甲醇，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；（9）显色液：准确称取DAB 7.0 mg，放入100 ml的烧杯，加0.01 M PBS(pH7.4)10 ml，搅拌使之完全溶解，加入饱和硫酸镍铵0.2 ml，显色前加入H2O2 20 µl；（10）一抗为兔抗人AFP Ig G ：DAKO公司生产；（11）二抗为HRP‑羊抗兔Ig G：西安华美公司生产；（12）磷酸盐缓冲液（0.01 M PBS）：称7.9 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH2PO4和1.8 g K2HPO4，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，去离子水定容至1 L，冷藏保存；（13）硝酸纤维膜：德国Protran TM公司生产。