[发明专利]一种分离检测AFP亚型的新方法

权利要求书

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型其特征在于包括以下组份：

（1）聚丙烯酰胺溶液：准确称取29.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入去离子水6 0ml，加热并搅拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去离子水冲洗烧杯数次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，过滤备用，冷藏保存；

（2）分离胶缓冲液：准确称取Tris 18.10 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 8.30，去离子水定容至100 ml，冷藏保存；

（3）浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.0 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 6.80，去离子水定容至100毫升，冷藏保存；

（4）过硫酸铵溶液：准确称取0.14 g过硫酸铵，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml搅拌溶解，避光冷藏保存；

 （5）上样缓冲液：1.0 M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)3.1 ml，5.0 ml甘油，1.0 g/L溴酚蓝0.5 ml，加去离子水至10 ml，冷藏保存；

（6）阳极电泳缓冲液：准确称取Tris 37.85g，吸取浓盐酸20.8 ml，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（7）阴极电泳缓冲液：准确称取Tris 22.8 g，硼酸45.0g，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（8）蛋白印迹（转移）缓冲液：准确称取甘氨酸2.90 g，Tris 5.80 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml，搅拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml无水甲醇，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（9）显色液：准确称取DAB 7.0 mg，放入100 ml的烧杯，加0.01 M PBS(pH7.4)10 ml，搅拌使之完全溶解，加入饱和硫酸镍铵0.2 ml，显色前加入H₂O₂ 20 μl；

（10）一抗为兔抗人AFP Ig G ：DAKO公司生产；

（11）二抗为HRP-羊抗兔Ig G：西安华美公司生产；

（12）磷酸盐缓冲液（0.01 M PBS）：称7.9 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH₂PO₄和1.8 g K₂HPO₄，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，去离子水定容至1 L，冷藏保存；

（13）硝酸纤维膜：德国Protran TM公司生产。

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型其特征在于包括以下步骤：

（1）制胶：使用14ml体积垂直平板电泳槽，胶厚1mm，玻璃板间下端先以10.0 g/L琼脂糖封口，按下表所示量分别配制聚丙烯酰胺浓度分别为88.0g/L的分离胶及50.0g/L的浓缩胶，静置待凝；

（2）加样：电泳取4 μl上样缓冲液及14 μl血清样品混匀，分别加入电泳胶板的每个加样孔，将电泳胶板放入电泳槽，在上槽中加入阴极电泳缓冲液，下槽中加入阳极电泳缓冲液，并将电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，60 V稳压电泳约1 h后，调整电压为100 V，电泳3.5 h结束电泳；

（3）转移：小心取下凝胶，在左下角做好标记，放入已加入转移缓冲液的培养皿内，摇床上平稳摇动，换液三次，每次摇动5分钟，在此之前约半小时事先用转移缓冲液浸透转移电泳槽、滤纸和硝酸纤维膜（NC膜），在转移电泳槽的下层碳板（即阳极碳板）上按从下到上的顺序依次放好24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸，每层均要小心缓慢赶走气泡，轻轻放上阴极碳板，电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，设置为稳流，按每平方厘米NC膜面积电流为1mA设置，转移3.5 h；

（4）包被：转移结束后，取出NC膜置培养皿中，以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min；

称取1.0 g脱脂奶粉，溶解于20 ml的0.01 M PBS中，倒入洗好的NC膜上，37℃水浴1 h；

（5）抗原抗体反应：弃去牛奶，0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min，加入1:100 稀释的兔抗人AFP IgG，置湿盒4℃冰箱过夜或37℃水浴1 h，再以0.01 M PBS 洗NC膜三次，每次5 min，再加入1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃水浴1 h；

（6）显色：以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min，置DAB显色液中避光显色3 min，弃去DAB显色液，流水冲洗终止反应，肉眼观察AFP区带分布情况。