[发明专利]一种分离检测AFP亚型的新方法

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种肝癌特异性AFP亚型（Hepatoma-specific Alpha-fetoprotein Isoform，HS-AFP）分离检测法，具体为应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术定性检测血清样本中的HS-AFP。人外周血中HS-AFP的增加与原发性肝癌的发生发展存在密切关联，运用该方法检测外周血中HS-AFP，对原发性肝癌的诊断、鉴别诊断、肝癌监测、手术预后判断及肝硬化癌变预测均具有较高价值。

背景技术

肝癌是最常见恶性肿瘤之一，其预后在很大程度上取决于能否得到早诊早治。肝癌

的诊断包括影像学的定位诊断和肝癌标志物的定性诊断。许多早期肝癌缺乏典型的影像学改变，此时定性诊断尤为重要。在我国肝癌发病的高危人群为慢性肝病尤其是乙肝后肝硬化患者，对这部分肝癌高危人群定期进行肝癌标志物检测对肝癌的早期诊断具有重要价值。血清甲胎蛋白（AFP）是公认最佳肝癌标志物，对肝癌的筛选、诊断以及复发监测均有重要价值。但许多小肝癌AFP浓度较低，出现AFP假阴性，而良性肝病有时也可出现AFP升高假阳性。因此单靠检测AFP水平不能满足临床需要。为进一步提高AFP对肝癌的诊断价值，许多学者对AFP亚型进行了研究，发现AFP存在糖链异构体。不同AFP糖链异构体与植物凝集素的亲和力不同，据此利用植物凝集素亲和电泳可将AFP分离出不同的亚型。肝癌患者血清中岩藻糖化的AFP增多，后者可与扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin A）有亲和作用，被命名为AFP-L3。近年来国外不少学者对AFP-L3对肝癌的诊断价值进行了研究，证实AFP-L3升高（占总AFP 15%以上）主要见于肝癌。良性肝病尽管会出现总AFP升高，但AFP-L3很少升高。AFP-L3在临床发现肝癌9～12个月之前即可出现阳性， AFP-L3还与患者的转移及生存期相关。因此，AFP-L3对肝癌的诊断、鉴别诊断以及病情监测价值远比血清AFP浓度为高。AFP亚型的另一种分离方法是根据不同AFP亚型间等电点的差别采用等电聚焦电泳法进行分离。Burditt等用等电点聚胶电泳将血清AFP分为4条区带，发现区带III和IV为肝癌特异性区带。Ho等也发现2条不同等电点的肝癌特异性区带，有助于AFP升高的良性肝病与肝癌的鉴别诊断。目前用于AFP亚型的检测方法都根据AFP糖链异构体与植物凝集素亲和力或等电点的差异而进行的。不但方法繁琐，更由于亲和电泳所需凝集素和等电聚焦电泳所需两性电解质价格都非常昂贵，故AFP亚型检测未能在临床上推广应用。

我们利用不连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶电泳体系分离AFP亚型，结合免疫印迹技术检测肝癌特异性AFP。既省去了昂贵的植物凝集素和两性电解质，大大降低检测成本，又简化操作，具有价廉、简便及重复性好的优点，且无需特殊条件及仪器，使肝癌特异性AFP检测能在临床推广应用。该方法国内外均未见其他相关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏特异、价廉、简便及重复性好的肝癌特异性AFP亚型检测方法。

本发明的目的是通过以下方法实现的：制备2个浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶，自上而下分别为88.0 g/L和 50.0 g/L，在每个加样孔中分别加入上样缓冲液及血清样品（混匀），以自然聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离肝癌特异性AFP亚型，再将AFP亚型从聚丙烯酰胺凝胶上转移至硝酸纤维膜，并与兔抗人AFP Ig G一抗反应，再加入HRP-羊抗兔Ig G二抗，最后以DAB显色。肉眼观察AFP区带分布情况。

本发明检测肝癌特异性AFP亚型方法，其包括以下组份：

（1）聚丙烯酰胺溶液：准确称取29.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入去离子水6 0ml，加热并搅拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去离子水冲洗烧杯数次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，过滤备用，冷藏保存。

（2）分离胶缓冲液：准确称取Tris 18.10 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 8.30，去离子水定容至100 ml，冷藏保存。

（3）浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.0 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 6.80，去离子水定容至100毫升，冷藏保存。