[发明专利]一种虫草金属硫蛋白的生产方法

摘要

本发明公开了一种虫草金属硫蛋白的生产方法，其具体步骤为：虫草菌→液体培养(添加硫酸锌诱导)→菌丝体过滤→富含金属硫蛋白的菌丝体→加缓冲液、研磨破碎细胞→加有机变性、搅拌，杂蛋白变性→离心去除杂蛋白→清夜加热变性→离心去除变性蛋白→迅速冷却至室温→超滤浓缩→浓缩液→G-50层析→巯基试剂法监测收集MT洗脱液→MT洗脱液真空冷冻干燥→MT冻干粉，本发明操作简单，生产周期短，菌丝体或子实体中MT产率高，可以进行工厂化生产。

主权项

一种虫草金属硫蛋白的生产方法，其特征在于其具体步骤为：(1)培养虫草属真菌菌丝体：将虫草属真菌进行试管斜面菌种培养(活化)、三角瓶液体种子培养、种子罐培养及发酵罐培养，发酵罐培养步骤的培养基为：每升培养液中葡萄糖10‑50g，蛋白胨5‑10g，酵母提取物1‑10g，硫酸锌5‑20g，pH值为5.0‑7.0；发酵罐投料体积60％‑80％，接种重量5‑10％，温度20～30℃，通气1∶0.3～0.8，搅拌转速80～150rpm，培养至菌丝体收得率大于等于1.2％，培养基还原糖含量小于等于0.2％时，放罐收获菌丝体；(2)板框过滤：将培养好的虫草属真菌菌丝体以板框过滤机过滤，经过板框过滤后取出菌丝体，得到的菌丝体可以用于金属硫蛋白的提取；(3)研磨使细胞破碎，杂蛋白变性：将上述菌丝体中加入相当于菌丝体重量1.5～3倍的0.05mol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)‑HCl，pH 8.6，用研磨机研磨、匀浆，至细胞破碎后，加入与菌丝体和Tris(三羟甲基氨基甲烷)‑HCl等重量的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的体积比为0.08∶1，变性除杂蛋白，搅拌约5～10min；将细胞破碎液于5000～10000r/min离心，弃沉淀，得上清液；上清液80～90℃热变性5‑10min，沉淀杂蛋白，静置0.5h以上，8000r/min以上离心弃沉淀，得上清液，为MT的粗提液；粗提液以截留分子量小于2000的膜超滤浓缩，得浓缩液；(4)柱层析：将上述的MT的提取液的浓缩液采用葡聚糖凝胶G‑50进行柱层析分离，以去离子水洗脱，在254nm检测洗脱液的吸收峰，吸收峰部分辅助以巯基试剂法监测，收集巯基试剂法监测到的最大吸收峰，即为金属硫蛋白部分；将柱层析得到的MT收集液冷冻干燥，得到虫草金属硫蛋白冻干粉。