[发明专利]转基因奶牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法

摘要

本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种转基因奶牛早期胚胎的性别鉴定领域。其步骤是应用显微操作技术从待检胚胎中切取4～6个细胞，用无菌超纯水冲洗后放入PCR管中，加入适量无菌超纯水，煮沸，置于碎冰中，冷却后在低温下离心，取上清夜进行PCR反应，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，得到电泳图，观察电泳图中同时出现131bp和250bp两条带的为公牛，只出现250bp条带的为母牛。

主权项

一种用于转基因奶牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法，其特征在于下列步骤：(1)试样的制备与保存从待检牛胚胎中切取4～6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0.5mLPCR管中，加入10uL无菌超纯水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷却后在4℃下离心5min，取上清液保存于4℃冰箱中，备用。(2)PCR反应以Y‑染色体特异性引物和常染色体内标引物扩增，PCR扩增的反应体系总体积为20uL，其中10×PCRBuffer 2uL，4dDNTP的浓度均为200pmol/L，引物浓度为5～20pmol/L，Tap酶2.5U，模板DNA10～100ng/uL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火25s；72℃延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃延伸5min。(3)PCR扩增产物检测取5uL PCR扩增产物，1％～5％琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是3V/cm～5V/cm，电泳20min～50min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，得到电泳图。其中，步骤(2)所用引物如下：Y‑染色体特异性引物    正向：5′‑TGATAGTTGATCCCACAGAAGG‑3′                      反向：5′‑TGAACTTACAAGCAGCTGAGG‑3′常染色体特异性引物    正向：5′‑TGAGGCATGGAACTCCGCTTG‑3′                      反向：5′‑GGTGGTTCCACATTCCGTAGG‑3′ 。