[发明专利]一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法

摘要

一种提高水牛胚胎体外生产效率的方法，在卵母细胞成熟液和培养液中分别添加10μL/mL和20μL/mL胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)进行体外成熟、体外培养。本发明表明，在成熟液中添加10μL/mL的ITS有效地提高了水牛卵母细胞的体外成熟率，第一极体的排出率高达65.61％。在胚胎培养液中添加20μL/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的发育，囊胚发育率高达29.93％。本发明的优点是提高了水牛卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率，从而提高了水牛胚胎的体外生产效率，为胚胎移植提供了大量优质的胚胎。

主权项

一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征包括下列步骤：(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于30～35℃无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室；从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞、外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞，用收集液洗涤2～3次。(2)将卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液、胰岛素‑转铁蛋白‑硒(insulin，transferrin and selenium，ITS)及含N‑2‑羟乙基哌嗪‑N′‑2‑乙磺酸(Hepes)的TCM199成熟培养液中洗2次，然后移入含有1.0mL成熟培养液的玻璃培养皿中，放入培养箱中进行体外成熟培养；成熟培养结束后统计卵母细胞成熟率。(3)体外受精使用细管冻精，37℃水浴解冻后采用上浮法分离精子；将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟培养液中拣出，用受精液洗涤2次后移入用受精液制成的受精滴中；将离心后的精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养。(4)体外受精培养18～20小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有胎牛血清及ITS的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，体外培养时间为8天；受精后第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。