[发明专利]一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法

权利要求书

1.一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征包括下列步骤：

(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于30～35℃无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室；从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞、外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞，用收集液洗涤2～3次。

(2)将卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液、胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin，transferrin and selenium，ITS)及含N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)的TCM199成熟培养液中洗2次，然后移入含有1.0mL成熟培养液的玻璃培养皿中，放入培养箱中进行体外成熟培养；成熟培养结束后统计卵母细胞成熟率。

(3)体外受精使用细管冻精，37℃水浴解冻后采用上浮法分离精子；将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟培养液中拣出，用受精液洗涤2次后移入用受精液制成的受精滴中；将离心后的精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养。

(4)体外受精培养18～20小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有胎牛血清及ITS的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，体外培养时间为8天；受精后第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。

2.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(1)中的收集液为TCM-199缓冲液，并添加有20mmol/L Hepes、5mmol/L NaHCO₃、3％胎牛血清和0.05mg/L的硫酸庆大霉素。

3.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(2)中成熟培养液为TCM199+5mmol/L Hepes+26.2mmol/L NaHCO₃+10％发情牛血清+0.5μg/mL促卵泡素+5μg/mL促黄体素+3％牛卵泡液+10μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素10μg/mL，转铁蛋白5.5μg/mL，硒5μg/mL)，培养时间为22～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度。

4.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(3)受精液为改进的Tyrodes培养液，添加有0.6％牛血清白蛋白、2.0mmoL/L咖啡因、20μg/mL的肝素，将活力良好的解冻精液注入到预先平衡好的装有2mL受精液的离心管中，于培养箱内倾斜45℃放置约30分钟，使离心管底部活力强的精子尽可能上浮至上层受精液中；取出离心管，吸取离心管上层含有精子的受精液，注入另一无菌离心管中，再加入2mL受精液，1500g离心5分钟，弃掉上清液；受精滴大小为45～50μL，每滴放入卵母细胞约20枚，将精子加到受精滴中，使精子浓度达到1～2×10⁶/mL，培养条件39℃，5％CO₂及最大饱和湿度，培养时间为18～20小时。

5.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(4)中的胚胎培养液为TCM199缓冲液+10％胎牛血清+20μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素20μg/mL，转铁蛋白11μg/mL，硒10μg/mL)，并用黄牛颗粒细胞作为单层与水牛胚胎进行共培养，培养条件39℃，5％CO₂及最大饱和湿度，体外培养时间为8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。