[发明专利]一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，特别涉及哺乳动物体外胚胎生产的方法。

背景技术

胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin，transferrin and selenium，ITS)主要由胰岛素、转铁蛋白和硒组成。胰岛素能刺激DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，促进对葡萄糖和氨基酸的利用，并通过对质膜，细胞骨架，细胞内酶和细胞核的作用来调节细胞功能。同时，胰岛素还有促进细胞有丝分裂的作用。转铁蛋白是一种血清球蛋白，与铁的转运有关，当细胞表面的受体与转铁蛋白结合后，可将铁转入细胞内；而细胞内参与O₂和CO₂的代谢和细胞呼吸过程的肌红蛋白和血红蛋白的合成主要依赖于蛋白质和铁。另外，转铁蛋白还可作为分解培养液中有毒金属物质的解毒蛋白。硒是胚胎发育过程中的一种必需微量元素，可通过调节谷胱甘肽过氧化物酶的活性起着抗氧化作用；同时，还有消除自由基，维持核酸、质膜和蛋白质的正常结构与功能的作用。研究证明这三种物质的联合对卵母细胞和胚胎的发育起着协同作用。ITS具有增强游离氨基酸的作用，而一些特殊氨基酸载体，内源性氨基酸池存在于早期胚胎中；ITS具有催化游离氨基酸的作用，而氨基酸又有助于早期胚胎克服发育阻滞现象。因此在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中添加ITS有利于早期胚胎的发育。

水牛是我国南方特有的品种，水牛奶具有很高的营养价值。但就目前我国奶水牛的现状来看，其数量和奶产量，还远远满足不了市场的需求。通过体外培养，生产大量优质的胚胎用于移植，产下更多的后代，既可以降低繁育成本，也可以在短期内迅速扩充水牛种群，从而推动水牛产业化的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法。在体外条件下，于成熟培养液和胚胎培养液中分别添加10μL/ml ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素10μg/mL，转铁蛋白5.5μg/mL，硒5μg/mL)和20μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素20μg/mL，转铁蛋白11μg/mL，硒10μg/mL)，可以显著提高水牛卵母细胞体外成熟率及囊胚发育率。通过该方法能显著地增加胚胎移植的数量及质量，从而能加速良种水牛的繁育速度，促进水牛产业的发展。

本发明的工艺步骤包括以下几步：

(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室。从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞、外形明亮、且细胞质均匀的卵母细胞，用收集液洗涤2～3次。

(2)将收集到的卵母细胞用成熟培养液洗3次后移入含10μL/mL ITS的成熟培养液中，放入培养箱中成熟培养22～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度；成熟培养结束后统计卵母细胞的成熟率。

(3)将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟培养液中拣出，用移液枪轻轻抽打去掉大部分卵丘细胞，用受精液洗涤2次后转入受精滴中。将经上浮、离心处理后的精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度。

(4)体外受精培养18～20小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于含有10％胎牛血清和20μL/mL ITS的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度；体外培养时间为8天。受精后第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。

与目前的体外胚胎生产技术相比，本发明的优点在于：

(1)目前尚未发现有关ITS对水牛卵母细胞体外胚胎生产方面的报道。因此，本发明将有望提高水牛体外胚胎的生产效率。

(2)成熟培养液中添加10μL/mL ITS有利于卵母细胞的体外成熟和受精后早期胚胎的发育。成熟液中添加10μL/mLITS成熟率高达65.61％。卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产技术中的关键环节，直接影响到卵母细胞体外成熟率和受精率的高低及受精卵早期发育的状况。在本试验体系下，成熟液中添加10μL/mL ITS显著地提高了卵母细胞的成熟率，其不仅为体外受精提供了更多优质的卵母细胞，也是囊胚发育率及囊胚的质量得以提高的先决条件。

(3)胚胎培养液中添加20μL/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的发育。胚胎培养液中添加20μL/mL ITS的囊胚发育率高达29.93％，高于国内外报道的平均囊胚率。这说明，在本试验体系下，培养液中添加20μL/mL ITS可以显著提高水牛囊胚发育率，从而提高了体外胚胎的生产效率。