[发明专利]一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法

摘要

本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、发卡结构连接和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列测定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过合成一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列；选用单一限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化后与发卡结构连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、引物特异性强、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。

主权项

一种发卡结构介导的PCR扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：选用限制性内切酶单酶切基因组DNA；将纯化的酶切产物与发卡结构进行连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物以及两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列；(1)引物及发卡结构的设计：依据已知DNA序列设计两条3′端特异性引物，命名为Primer‑R1和Primer‑R2(18‑22bp)；Primer‑R2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，它比Primer‑R1接近待测定的未知序列；设计一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列，命名为HSO(41bp)；基于HSO设计一条5′端特异性引物，命名为HSO‑F(18bp)；HSO：5′‑NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG‑3′或     5′‑CTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN‑3′，HSO‑F：5′‑ATCCGCCCATGCCAGTAG‑3’，其中：NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤(2)选用的限制性内切酶的特性而定；(2)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从Primer‑R1到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶；本发明可供选择常用的产生5′末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；产生3′末端突出四个碱基的有AatⅡ、PstⅠ、SacⅠ和SphⅠ等；产生5′末端突出两个碱基的有ClaⅠ、MspⅠ和NdeⅠ等；(3)发卡结构的形成：对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94℃热变性3min，随后缓慢降温至25℃并保持30min，即可形成发卡结构；(4)PCR模板的构建：采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化的酶切产物与步骤(3)形成的发卡结构进行连接，即可作为PCR模板；(5)巢式PCR扩增：以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO‑F和Primer‑R1为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO‑F和Primer‑R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。