[发明专利]杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法

摘要

本发明公开了一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化调控方法。该方法利用生长激素调节机理，逐步降低2，4-D浓度，附加0.5mg·L-1KT诱导出较为均一的胚性细胞团，然后采用机械过筛的方法将胚性细胞团分级培养，并根据细胞团大小和体胚发生方式的不同，选用不同的后续同步化控制方法。经上述同步化调控后，在球形胚阶段的经分级筛选的杂交鹅掌楸体胚发育同步率达90％左右；而在心形及鱼雷形胚阶段的分级处理同步化率在室温条件下为40％左右，经过适当时间的冷藏会使同步化的比率有所提高；由球形胚阶段的材料发育而来的成熟体胚向再生植株转化率可达70％～80％。

主权项

一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化调控方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在无菌条件下，按接种量为2g/50ml将保存在固体培养基上的胚性愈伤组织接入液体诱导培养基I，增殖培养，控温25±2℃，在转速为95r·min‑1的摇床上暗培养2～3周，获得初始材料；其中，每周继代一次，继代按体积比为1∶9将培养物接入液体诱导培养基I，液体诱导培养基I的配方为：MS培养基，2mg·L‑12，4‑D，0.2mg·L‑16‑BA，500mg·L‑1LH，30g·L‑1蔗糖；(2)按体积比为1∶9将步骤(1)获得的初始材料接入液体诱导培养基II，控温25±2℃，在转速为95r·min‑1的摇床上暗培养7～9d，获得悬浮培养物；其中，液体诱导培养基II的配方为：MS培养基，0.2mg·L‑12，4‑D，0.5mg·L‑1KT，200mg·L‑1CH，50g·L‑1蔗糖；(3)将步骤(2)悬浮培养物过孔径400μm、280μm、150μm、38μm网筛，并按不同孔径分层收集细胞，分别铺于滤纸上，然后置于半固体成熟培养基上培养2～5周后获得同步的成熟胚；其中，半固体成熟培养基的配方为：MS培养基，2～10mg·L‑1ABA，2g·L‑1AC，100mg·L‑1CH，40g·L‑1蔗糖，5g·L‑1琼脂；(4)将成熟胚转移至生长培养基上促进萌发生长，将萌发的小植株转至植株生长培养基上培养，即获得再生植株；其中，生长培养基配方为：MS培养基，1mg·L‑1ABA，30g·L‑1蔗糖，6.5g·L‑1琼脂；植株生长培养基配方为：MS培养基，30g·L‑1蔗糖，6.5g·L‑1琼脂；培养条件均为：25±2℃，16h(光照)/8h(黑暗)培养。