[发明专利]杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法

权利要求书

1.一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化调控方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下，按接种量为2g/50ml将保存在固体培养基上的胚性愈伤组织接入液体诱导培养基I，增殖培养，控温25±2℃，在转速为95r·min^-1的摇床上暗培养2～3周，获得初始材料；其中，每周继代一次，继代按体积比为1∶9将培养物接入液体诱导培养基I，液体诱导培养基I的配方为：MS培养基，2mg·L^-12，4-D，0.2mg·L^-16-BA，500mg·L^-1LH，30g·L^-1蔗糖；

(2)按体积比为1∶9将步骤(1)获得的初始材料接入液体诱导培养基II，控温25±2℃，在转速为95r·min^-1的摇床上暗培养7～9d，获得悬浮培养物；其中，液体诱导培养基II的配方为：MS培养基，0.2mg·L^-12，4-D，0.5mg·L^-1KT，200mg·L^-1CH，50g·L^-1蔗糖；

(3)将步骤(2)悬浮培养物过孔径400μm、280μm、150μm、38μm网筛，并按不同孔径分层收集细胞，分别铺于滤纸上，然后置于半固体成熟培养基上培养2～5周后获得同步的成熟胚；其中，半固体成熟培养基的配方为：MS培养基，2～10mg·L^-1ABA，2g·L^-1AC，100mg·L^-1CH，40g·L^-1蔗糖，5g·L^-1琼脂；

(4)将成熟胚转移至生长培养基上促进萌发生长，将萌发的小植株转至植株生长培养基上培养，即获得再生植株；其中，生长培养基配方为：MS培养基，1mg·L^-1ABA，30g·L^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂；植株生长培养基配方为：MS培养基，30g·L^-1蔗糖，6.5g·L^-1琼脂；培养条件均为：25±2℃，16h(光照)/8h(黑暗)培养。

2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于：步骤(3)中，收集38～150μm的胚性细胞于液体诱导培养基II中培养10～15d，再次过筛，收集150～280μm的球形胚状体，将收集到的球形胚状体转入液体成熟培养基中培养，两周后得到同步的成熟胚。其中，液体成熟培养基的配方为：MS培养基，2～10mg·L^-1ABA，100mg·L^-1CH，40g·L^-1蔗糖。

3.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于：步骤(3)中，收集150～280μm和280～400μm的细胞团，分别将其转至步骤3所述半固体成熟培养基或进行步骤(2)培养。

4.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，其特征在于：步骤(3)中，将大于400μm的细胞团按照步骤(1)继续增殖，并依次按照步骤(2)、(3)和(4)操作，实现循环培养。