[发明专利]杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法

说明书

技术领域

本发明涉及林业中的种苗繁殖生物技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法。

背景技术

木兰科鹅掌楸属(Liriodendron)树种在自然界仅存两个种，即北美鹅掌楸(L.tulipifera Linn.)和鹅掌楸(L.chinense(Hemse.)Sarg)，现存资源十分稀少，是我国二级珍惜濒危保护树种。鹅掌楸具有生长迅速，干形直，木材用途广，叶和花观赏价值高等特点，特别是南京林业大学叶培忠教授等人利用中国马褂木与北美鹅掌楸杂交试验成功获得杂交鹅掌楸(Liriodendron chinense×L.tulipifera)，具有明显的杂种优势，其生长速度快，抗性强，树姿优美，花色美丽，叶形独特，病虫害少，材质纹理细腻，易加工，是集荒山造林、工业用材、园林观赏、绿化等多种用途于一身的优良树种，市场前景广阔。

目前杂交鹅掌楸主要通过人工杂交的有性繁殖及扦插、嫁接等传统方法进行繁殖。但杂交制种效率低、种子量少，F1代的种子发芽率很低，同时由于扦插生根难(季孔庶，2005)，而嫁接繁殖系数又低，很大程度上限制了优良杂种的快速繁殖和利用，因此以传统的繁殖方式育苗，速度缓慢，优良种苗数量远远供不应求。有学者报导过杂交鹅掌楸植物组织培养途径进行快速繁殖的一些研究(刘根林，2000；陈金慧等，2002；蒋泽平等，2004；蔡桁等，2005；田敏等，2006)，但均未见生产性应用。相对于传统的育苗方式，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。陈金慧等于2003年利用固体培养基培养杂交鹅掌楸未成熟胚，成功诱导了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生，使杂交鹅掌楸的快速繁育体系取得了重大进展，并成功进入工厂化生产育苗，在很大程度上缓解了市场供需矛盾，但杂交鹅掌楸种苗的供应仍然不能满足市场的需求。

植株再生无疑为解决这种供需矛盾提供了一种有效方案，并且一个成熟的体胚发生悬浮体系对进行植物体细胞杂交、遗传转化、植物种质资源的超低温保存以及对植物体胚发育等方面的研究提供了极大的便利。同时，悬浮培养中同步化的实现，是利用生物反应器建立规模化培养体系的基础，同时也是研究体胚发生分子机理的理想平台，因此实现悬浮培养中体胚发生的同步化控制显得尤为重要。

培养同步分裂的细胞群，可以在人工的控制下获得具有同样代谢活性和功能的细胞所组成的大群体，为获得同步形态发生的胚状体奠定基础。体胚的同步化是指促使所有培养的细胞或发育中的细胞团块进入同一个分裂时期，只有同步化了细胞才可能成批地产出成熟胚胎。因此控制体胚的同步发生要从控制细胞的同步分裂开始，目前控制细胞同步分裂的常用方法主要是化学诱导和物理选择。大多时候单一的同步化控制方法并不能取得最佳效果，这就需要将两种或多种方法综合应用。根据所选外植体的生物性状及生理生化特点采用不同的方法组合或试剂组合达到最佳的同步诱导效果。

关于鹅掌楸属体胚发生的悬浮培养体系，仅有Scott Merkle等(1991)报道过北美鹅掌楸的体胚发生，但未见大规模生产的报道。目前，通过对杂交鹅掌楸的胚胎发生过程进行的扫描电镜观察以及对这一过程中ATP酶活性进行的超微细胞化学定位，对于非胚性细胞向胚性细胞的转化，胚性细胞的进一步发育分化，以及体细胞胚胎发生中胚性细胞的起源及发育已有了初步的了解，同时对体胚系统的遗传稳定性的分析表明，杂交鹅掌楸体细胞胚胎再生体系具有长时间保持旺盛的体胚发生能力(陈金慧等，2006)。陈志等(2007)也通过对影响悬浮培养的一些物理因素如摇床转速、细胞起始密度，继代周期，悬浮物的选择等的研究初步建立了杂交鹅掌楸胚性愈伤悬浮培养体系，但高频、同步的杂交鹅掌楸体胚发生悬浮培养体系的建立还未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，为满足杂交鹅掌楸的大规模生产提供有效的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的杂交鹅掌楸体胚发生同步化控制方法，以悬浮培养条件下的胚性细胞为起始材料，在液体培养基上进行扩大培养并使细胞分散，采用物理过筛和密度梯度离心结合的方法使植物细胞群大小均一，同时调节激素的种类和用量诱导植物细胞胚性，调整液体培养物密度分级转接到含有适量ABA的培养基上，加大渗透压，促使体胚高频同步发生，最后获得生长状态正常一致的再生植株。具体实施包括以下步骤：

(1)杂交鹅掌楸愈伤细胞悬浮系扩大培养