[发明专利]一种制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法

摘要

本发明公开了一种制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法。该方法选取乙酸-乙酸钠缓冲溶液低温浸提麦曲中微生物胞外酶，通过使用含有二硫苏糖醇和三氯乙酸的预冷丙酮溶液Ⅰ沉淀蛋白并用含有二硫苏糖醇的预冷丙酮溶液漂洗沉淀，最后加入裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。本发明制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

主权项

一种制备绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶双向电泳样品的方法，包括以下步骤：1)称取一定质量的绍兴黄酒成品麦曲，加入适当体积浓度为0.09‑0.15mol/L，pH3.8‑5.5的乙酸‑乙酸钠缓冲溶液，同时加入1片蛋白酶抑制剂混合片，在4℃条件下浸提4‑12h；然后依次用4层纱布和滤纸过滤，得滤液。利用冷冻高速离心机使滤液在4℃，10000r/min条件下离心30min，收集上清液；2)向步骤1)得到的粗酶提取液中加入4‑6倍体积预冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含0.01‑0.03mol/L的二硫苏糖醇，0.05‑0.2g/mL的三氯乙酸)，混匀，‑20℃放置1h；低温高速离心收集沉淀，向沉淀中加入2mL预冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含0.01‑0.03mol/L的二硫苏糖醇)，清洗沉淀，‑20℃放置1h；低温高速离心收集沉淀，采用预冷的丙酮溶液Ⅱ重复清洗沉淀一次；用保鲜膜封盖装有蛋白沉淀的离心管管口，‑20℃挥发残留丙酮；3)将步骤2)中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液(其中含6‑8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、体积百分含量为0.5‑2％的IPG缓冲液、0.002g/mL的溴酚蓝)，室温下充分溶解，离心取上清液，此上清液即为绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶双向电泳样品；所述裂解液组成为样品裂解液为8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、体积百分含量为0.5％的IPG缓冲液、0.002g/mL的溴酚蓝。