[发明专利]基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法

摘要

本发明是基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法，属于农业生物技术范畴。28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法是测定叶螨不同属物种的一段特定28S-rRNA序列，通过序列分析软件计算各物种遗传距离和构建系统发育树，从而对各物种进行快速区分。本发明根据叶螨28S-rRNA基因序列设计了一对新的特异性引物，可扩增出多态性的目的片段，长度约为547-578bp。本发明所述叶螨分属的快速鉴定方法迅速、简单、可靠，既节约成本，又省时高效。用核糖体28S-rRNA分子鉴定技术可广泛用于叶螨分属水平上的鉴定。

主权项

基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法，其特征在于：1)提取叶螨总DNA挑单头雌成螨放入25μl STE缓冲液中进行碾磨，加入2μl 10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制：100mMNaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，提取DNA；2)PCR扩增根据GenBank上登录的叶螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物：即上游引物28S-F：5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物28S-R：5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’，以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，反应体系：ddH2O                    30.6μL10×Buffer               5μLMg2Cl 25mM               5μLDNTP 2.5mM               4μLPrimer 28S-F    20μM    1.5μLPrimer 28S-R    20μM    1.5μLTaq DNA聚合酶5U/μm      0.4μLDNA模板                  2.0μL总体积                   50μL扩增条件：预变性：94℃，4min；30个循环：变性92℃，1min，退火55℃，1min，延伸72℃，1min；3)克隆和测序：利用AXYGEN回收试剂盒对PCR产物进行纯化，再将纯化产物连接到pGEM-T载体，最后导入感受态大肠杆菌DH5a中进行振荡培养，挑取培养基中长出的白斑，在LB培养液中培养，将菌液送到测序公司进行测序，每个种群取三个样品进行克隆和测序，以它们的一致序列为准；4)序列数据分析获得的未知物种DNA序列用BLAST工具进行检索并从Genebank下载同源性相近的物种序列，下载序列要求：同一属不同物种2条以上，至少3个不同属；对同源性DNA序列用Clustal X 1.81软件进行序列比对生成aln文件；将生成的aln文件用MEGA 4.01软件转换生成me、文件；采用距离法计算各样间的遗传距离，遗传距离小于2％的为同一属的物种，遗传距离远大于2％的为不同属的物种；基于p-distance模型，用邻接法构建系统发育树，通过1000次检验获得系统树分支的置信度；同一属的物种以99％的置信度处在同一进化枝上，未知物种获得属种分类。