[发明专利]一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法

摘要

本发明公开了一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法，其包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3：pDsRed1-C1-LPL载体的构建；A4：shRNA有效序列的筛选；由于采用红光和绿光两种不同荧光分别标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以同时筛选多条序列。

主权项

一种脂蛋白脂酶基因有效shRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；根据GenBank公布的西农萨能羊LPL序列，设计三条LPL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔，使单链DNA寡核苷酸内部形成发夹结构，每对单链DNA寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA的正、反义链模板；A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建：A21：单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链DNA寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火条件是：95℃×4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列，分别标记为：ds435、ds876、ds1150；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22：构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切pENTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds435、所述ds876和所述ds1150分别与pENTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4℃连接过夜，得到连接产物；A23：连接产物转化；取10μL所述连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，置冰浴12分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育；A24：筛选穿梭载体克隆；A3：pDsRed1-C1-LPL载体的构建：A31：构建pDsRed1-C1-LPL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM-T载体连接，16℃恒温过夜，连接产物转化感受态E.coliDH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取10μL反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pGM-T-LPL，10.0μL；ddH2O，6.6μL；总体积20.0μL；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段；A32：构建pDsRed1-C1-LPL表达载体；A4：shRNA有效序列的筛选：A41：去内毒素质粒提取；A42：细胞的复苏；A43细胞传代培养：A44：细胞转染。