[发明专利]一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法

摘要

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，属生物制剂检测技术领域，其特征在于包括以下步骤：根据茶尺蠖核型多角体病毒基因序列设计一对引物，并从感染该病毒的虫体中提取茶尺蠖核型多角体病毒基因组DNA，进行PCR扩增，将该基因片段与载体pMD18-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒，以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好，相关系数为0.989，检测范围为103～108拷贝/μL，特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数，为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。

主权项

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据茶尺蠖核型多角体病毒的p10基因设计一对引物，引物核苷酸序列如下：EoNPV p10F：5’-actgctctgcagcaacaagtcg-3’；EoNPV p10R：5’-gtcgttgacggtggtgctaatc-3’；2)从感染茶尺蠖核型多角体病毒的虫体中提取茶尺蠖核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物，PCR扩增得到p10基因片段；3)制备质粒标准品并测定其浓度：将扩增获得的p10基因片段与载体pMD18-T连接，转化入大肠杆菌TG1中，挑单克隆菌株，摇菌；采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于-20℃冰箱中，备用；重组质粒序列如下：5’-actgctctgcagcaacaagtcgaagatgtccgcaccaatttgcccgacaccacggagctgaacaccaaactggacgctcaggctcagagcctggacacgattagcaccaccgtcaacgac-3’；4)荧光定量PCR反应建立标准曲线：将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其实模板数的对数为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测尺蠖核型多角体病毒的标准曲线；5)样品检测：提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，计算待测样品的浓度。