[发明专利]多重扩增与检测

摘要

本发明涉及多重扩增的领域。本发明尤其涉及在单次反应中，基于引物和/或探针的不同熔解温度或熔解图谱，检测一份样品中一种或更多种目标(靶)核酸的方法。本发明还提供了用于此类方法的探针和试剂盒。

主权项

一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括：(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包括：(i)一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸，(ii)两个或更多个探针，其中每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；(b)在扩增条件下，在所述样品/反应混合物上进行扩增反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸与所述靶核酸杂交，因此被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及(c)通过检测来自在未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征，其中所述探针的所述至少两个中的第一探针具有依据所述第一探针的双链部分的熔解温度Tm1，其中所述探针的所述至少两个中的第二探针具有依据所述第二探针的双链部分的熔解温度Tm2，其中Tm1＞Tm2，其中所述相同的标记物被独立地附接到所述第一和第二探针，其中在Tm1和/或Tm2的任一熔解峰的降低提供所述一个或多个第一和/或第二探针的消耗的指征。