[发明专利]寻找先天性心脏病-室间隔缺损致病相关的ALK3下游基因的方法

摘要

本发明公开了一种寻找先天性心脏病-室间隔缺损致病相关的ALK3下游基因的方法，采用α-MHC Cre+/-，ALK3F/-(试验组)和α-MHC Cre+/-，ALK3F/+(对照组)的小鼠胚胎(11.5天)，用PCR选择性cDNA差异显示法和基因芯片法初筛获得可能的ALK3下游候选基因，然后采用成本较低的RT-PCR排除假阳性的ALK3下游候选基因，然后再通过原位杂交法对经RT-PCR法排除后余下的ALK3下游候选基因进行表达部位验证，证实其为先天性心脏病-室间隔缺损致病相关的ALK3下游基因。本发明为开发室间隔缺损的基因治疗药物打下理论基础，也为探索新药找到新的治疗靶点。

主权项

一种寻找先天性心脏病-室间隔缺损致病相关的ALK3下游基因的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、试验组和对照组的设置，其中试验组：α-MHC Cre+/-，ALK3F/-的ALK3基因敲除的纯合子小鼠胚胎；对照组：α-MHC Cre+/-，ALK3F/+的ALK3基因敲除杂合子小鼠胚胎；(2)、总RNA和mRNA的提取：采用总RNA和mRNA试剂盒分别从试验组和对照组中收拾到的11.5天胚胎心脏中提取和纯化总RNA和mRNA；(3)、初步筛选有差异表达的ALK3的下游候选基因3.1、分别将试验组和对照组的mRNA逆转录成cDNA，采用PCR选择性cDNA差异显示法的试剂盒，比较并初步筛选出分别在试验组和对照组有差异表达的候选基因；3.2、并且再利用至少含25,000小鼠基因片段的芯片比较试验组和对照组的基因表达水平，得到在试验组基因表达水平上调的一组候选基因和下调的一组候选基因；(4)、RT-PCR的方法排除假阳性的候选基因，采用同等量试验组和对照组总RNA被反转录成cDNA，再采用每个候选基因特异的PCR引物，做不同周期的聚合酶链式扩增，并以GAPDH基因作为RT-PCR的内部对照基因，比较各个候选基因在不同周期的PCR的产物量，排除假阳性的候选基因；(5)、采用原位杂交法对经步骤(4)筛选后的候选基因的表达部位进行试验组和对照组的对照显示，进一步验证得到先天性心脏病-室间隔缺损致病相关的ALK3下游基因。