[发明专利]一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用

摘要

本发明公开了一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，采用在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标，通过碱基重排、引物设计和搭桥法PCR扩增，构建了一条IAC片段，通过碱基重排和搭桥法PCR扩增，内标模板添加浓度为每个反应102拷贝，Mg2+2.0mmol/L，dNTP各0.3mmol/L，引物各0.5mmol/L，探针各0.2mmol/L，扩增条件为50℃，2min，1个循环；95℃，5min，1个循环；95℃15s，60℃60s，45个循环，能够准确显示抑制成分的存在或指示假阴性的发生。该方法灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍。该方法广泛应用于检测牛传染性鼻气管炎病毒领域。

主权项

一种牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下：(1)根据BHV-1 gB基因序列设计扩增出141bp的特异性引物Ip2、Ir2和荧光探针ITpro，模板构建引物Ip1和Ir1，其中Ip1、Ir1位于Ip2、Ir2外侧，扩增出长度为787bp的片段；将探针ITpro序列进行重排，设计引物Ic1和Ic2，通过人为添加的接头序列，构建内标探针ICpro；(2)将BHV-1经细胞培养增殖，冻融后取上清液用DNAZo1提取液提取病毒DNA；精液用Sephacryl S-400凝胶过滤后，用DNAZo1进行核酸提取；以病毒DNA为模板，用Ip1和Ir1为扩增引物，反应条件为：95℃变性5min；96℃1min，50℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃延伸10min；扩增产物经凝胶纯化回收，连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定后，构建质粒IT；(3)以质粒IT为模板，分别采用引物Ip1、Ic1和Ic2、Ir1为配对引物进行PCR扩增，Ip1、Ic1的扩增条件为：95℃5min；96℃1min，56℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；Ic2、Ir1的扩增条件为：95℃5min；96℃1min，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；将扩增产物Ip1c1、Ic2r1等量混合后作为模板，用引物Ip1和Ir1进行PCR扩增，反应条件为：95℃变性5min；96℃1min，50℃1min，72℃2min，35个循环；最后在72℃延伸10min；将扩增后的产物纯化回收并连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR及测序鉴定，构建质粒IC；(4)分别以质粒IT和IC为模板，分别以Ip1、Ir1、ITpro和Ip1、Ir1、ICpro为引物和探针进行扩增，dNTP浓度为0.15～3.0mmol/L，引物浓度为0.2～0.6mmol/L，探针浓度为0.1～0.4mmol/L，Mg2+浓度为1.0～4.0mmol/L，Taq DNA聚合酶为1.25～2.5u，Tm为59～61℃，循环参数为40、45和50；(5)分别以不同浓度的IT与IC混合物为模板，以Ip1、Ir1、ITpro和ICpro为引物和探针进行荧光PCR共扩增，确定共扩增反应体系中IC模板的添加浓度。