[发明专利]组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用

摘要

组织金属蛋白酶抑制因子siRNA表达载体的构建及肝硬化治疗应用，本发明属于基因工程技术领域。本发明根据siRNA的设计原理，分别选择TIMP-1和TIMP-2编码区的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，进行BLAST比较，避免与其他基因同源，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pGeneil-1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了TIMP-1和TIMP-2的siRNA表达载体，该载体经脂质体转染肝星状细胞(HSC)，能明显抑制TIMP-1和TIMP-2的表达；上述表达载体，通过肝硬化动物模型验证，能明显地降低肝组织的胶原纤维沉积，可望成为一种新型的抗肝纤维化的基因疗法应用到临床治疗中。

主权项

本发明在构建针对基质金属蛋白酶组织抑制因子1和2(TIMP‑1、TIMP‑2)siRNA表达载体时，分别设计TIMP‑1、TIMP‑2siRMA转录模板DNA，根据pGeneil‑1载体的要求，每段设计1对各长69nt的寡核苷酸，每条寡核苷酸包括：两端用于形成酶切位点(BamHI和HindIII)的序列、2lnt的TIMP编码区序列(TIMP‑1297nt‑317nt、TIMP‑255lnt‑57lnt)、用于形成茎环的9nt序列、反向互补序列、作为终止信号的6个胸腺嘧啶核苷(T)。与真核表达载体pGeneil‑1连接，构建了靶向基质金属蛋白酶组织抑制因子1和2(TIMP‑1、TIMP‑2)基因序列的siRNA表达载体。