[发明专利]从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及分离所得神经元的用途

摘要

本发明涉及从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤：取新鲜人胎盘，将人羊膜剥离，用生理盐水反复冲洗除后，用无菌D-hank’s液浸泡，再用生理盐水漂洗；将人羊膜置于0.25％胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃温度下消化；用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分化培养基继续培养；收获上述多巴胺能神经元样细胞。

主权项

一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤：(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块，然后用无菌D-hank’s液浸泡1.2-2个小时后，再用生理盐水漂洗2-5次；(2)将漂洗过的人羊膜组织置于0.25％的胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃的温度下消化10-20分钟；(3)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用180-220目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分化培养基继续培养；(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了包括多巴胺能神经元样细胞的细胞；(7)收获上述所有细胞。