[发明专利]从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及分离所得神经元的用途

权利要求书

1.一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块， 然后用无菌D-hank’s液浸泡1.2-2个小时后，再用生理盐水漂洗2-5次；

(2)将漂洗过的人羊膜组织置于0.25％的胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃的温 度下消化10-20分钟；

(3)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消 化，然后用180-220目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；

(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上 述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；

(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细 胞分化培养基继续培养，其中：神经干细胞分化培养基每毫升含有：15％的血清、200ng的 Sonic hedgehog SHH、100ng的成纤维细胞生长因子8、10ng的碱性成纤维细胞生长因子8、 200μM的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子；

(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收 获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了包 括多巴胺能神经元样细胞的细胞；

(7)收获步骤(6)得到含有多巴胺能神经元样细胞的细胞。

2.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：所述的步骤(1)中的无菌D-hank’s液含有：1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、 100U/ml庆大霉素和2.5ng/ml两性霉素。

3.如权利要求2所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：在所述的步骤(1)中，人羊膜组织用无菌D-hank’s液浸泡1.5个小时后，再用浓 度为0.9％的生理盐水漂洗3次。

4.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：在所述的步骤(2)中，人羊膜在37.℃的温度下消化15分钟。

5.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：在所述的步骤(3)中，用200目细胞筛对上述溶液进行过滤。

6.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：所述的步骤(6)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后 在倒置生物显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。

7.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：所述的步骤(4)中的体外传代培养的环境是在温度为37℃、湿度为95％和5％的 二氧化碳的孵化箱内进行的，步骤(5)中人羊膜上皮细胞的一代的繁殖时间为10-12天。

8.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于：所述的无菌D-hank’s、DMEM/F12和无胎牛血清的培养基为市售产品。