[发明专利]从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及分离所得神经元的用途

说明书

技术领域

本发明涉及了一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及其用该方 法得到的多巴胺能神经元来治疗帕金森综合症的用途。

背景技术

帕金森综合症是一种自发的、缓慢发展的、中枢神经系统退化性的疾病，它的发病特 征为运动缓慢、肌肉僵硬、静止震颤和姿势不稳。现已发现：它是由黑色、蓝斑以及其它 脑干多巴胺能细胞中着色的神经元持续恶化后所产生的症状，导致神经递质多巴胺的缺失。 在中年以上的人群中，帕金森综合症是危害人们身体健康的第四种常见的神经退化疾病， 它影响了0.4％的年过40岁的人和1％的年过65岁的人。不管患者年龄的大小，对于那些 受到该疾病折磨的患者来说，常常造成毁灭性的结果。造成这种结果的原因是对多巴胺能 神经元的破坏是不可逆的。对于这种疾病的治疗主要希望是发展神经网络的细胞群体，并 使神经系统的功能恢复协调。有些证据已经显示胎儿多巴胺能神经元可恢复帕金森综合症 的化学异常。但是至今没有找到适当的组织。

发明内容

本申请的发明目的在于：发现从健康产妇分娩后废弃物人胎盘上的人羊膜组织组织内 的人羊膜上皮细胞中存在许多用于治疗帕金森综合症的多巴胺能神经元，而提供一种从人 羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及其用该方法得到的多巴胺能神经元来 治疗帕金森综合症的用途。

本发明的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法通过以下方式进行实 施：

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以 下步骤：

(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块，然 后用无菌D-hank’s液浸泡1.2-2个小时后，再用生理盐水漂洗2-5次；

(2)将漂洗过的人羊膜置于0.25％的胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃的温度下消化 10-20分钟；

(3)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜组织在胰蛋白酶溶液中的消 化，然后用180-220目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；

(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上述人 羊膜上皮细胞进行体外传代培养；

(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分 化培养基继续培养；

(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收获部 分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了含有多巴 胺能神经元样细胞的细胞；

(7)收获所有上述细胞。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述的 步骤(1)中的无菌D-hank’s液含有：1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、100U/ml庆大 霉素和2.5ng/ml两性霉素。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：在所述 的步骤(1)中，人羊膜组织用无菌D-hank’s液浸泡1.5个小时后，再用浓度为0.9％的生理 盐水漂洗3次。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：在所述 的步骤(2)中，人羊膜在37.℃的温度下消化15分钟。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：在所述 的步骤(3)中，用200目细胞筛对上述溶液进行过滤。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述的 步骤(5)中的神经干细胞基础培养基每毫升含有：15％的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、100ng的成纤维细胞生长因子8、10ng的碱性成纤维细胞生长因子8、200μM的维 生素C和20ng的脑源性神经营养因子。

本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：：所述的 步骤(6)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后在倒置生物显微 镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。