[发明专利]组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2对脑卒中的治疗作用及制备方法

摘要

本发明涉及医药生物工程技术领域，包括组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽的制备及应用。本发明使用两种方法制备组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2。方法一，人源组织型纤溶酶原激活物变体瑞替普酶(reteplase)作为原料，使用纤溶酶原(plasminogen)切割瑞替普酶(reteplase)得到由二硫键连接的环饼结构-2(kringle-2)和碳端丝氨酸蛋白酶组成的多肽。使用β-巯基乙醇限制性还原断裂二硫键，H2O2限制性氧化。用lysine-Sepharose 4B亲和层析进一步纯化环饼结构-2多肽。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯度。方法二，利用PCR技术获得环饼结构-2基因，将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中。重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，其产物以包涵体形式存在，通过体外复性，得到可溶性的环饼结构-2。在脑缺血后给予环饼结构-2，可降低脑卒中大鼠死亡率；减少脑梗死体积；降低内源tPA的表达；调节BBB开放模式，使得BBB在脑缺血后24小时BBB通透性降低，有效的防止了脑水肿发生；减少脑神经元凋亡。组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽主要用于脑卒中的治疗，也可用于脑损伤以及神经退行性病的神经保护。

主权项

环饼结构-2多肽(Kringle2)制备方法在于：2mg/mL reteplase与2μg/mL人源plasminogen在digest buffer(100mmol/L PBS，0.7mol/LArg，pH8.0)中37℃酶切过夜。反应混合物在室温用β-巯基乙醇(5mmol/L)限制性还原2小时，然后用H2O2(0.1mmol/L)室温氧化1小时，破坏kringle2结构域与P结构域之间的二硫键。用lysine-Sepharose 4B column进一步纯化Kringle2多肽。所得Kringle2多肽对100mMPBS透析。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯度。脑缺血后脑室注射kringle2用于脑缺血后脑保护。