[发明专利]组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2对脑卒中的治疗作用及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域。

背景技术

组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)是一种丝氨酸蛋白酶。tPA具有缺血脑保护作用^1，2，但由于丝氨酸蛋白酶结构域会增大缺血脑损伤，因此不宜直接用作脑保护药物。我们制备了一系列含有tPA不同结构域的变体，首次发现tPA分子中环饼结构2(Kringle2)结构域具有比tPA更强缺血脑保护作用，并将其用于急性脑卒中的治疗。环饼结构又叫“Kringle”，包含大约90个氨基酸和3个二硫键，是广泛存在于脊椎动物plasminogen-prothrombin家族酶中的结构域，主要作用是介导分子之间的相互识别，如人的APOA含有38个kringle结构。tPA kringle2主要功能是与纤维蛋白、纤溶酶及肝素上的赖氨酸或精氨酸结合，晶体结构显示62位和72位的Trp介导了这种作用³。tPA在缺血性脑损伤中可以作为神经递质，拮抗Zn²⁺在局灶性脑缺血时引起的毒性作用，参与了脑缺血神经元保护作用⁴。脑缺血以后，tPA能够调节微循环，提高缺血后的脑血流⁵。脑缺血时tPA酶切活化latent-PDGF-CC，通过星形胶质细胞上的PDGF-R受体，调节BBB开放。脑中tPA可同时在神经元细胞和神经胶质细胞中表达。生理条件下，tPA具有细胞因子样作用，参与突触生长、神经元细胞迁移、轴突生长以及活化BDNF参与LTP(long-term potentiation)等作用；病理状态下，如癫痫，可作为立即早期基因被诱导^6，7。用于临床的r-tPA(alteplase)主要为单链形式(大约占70％)，tPA双链形式为一条带有氨基端的A链(1～275残基)通过一个二硫键连接于带有羧基端的B链(276～527残基)。tPA有5种不同的结构域，A链由锌指(F)结构域、生长因子(G)结构域和两个“环饼结构”区(Kringle1，Kringle2)组成；B链为一个丝氨酸蛋白酶区(P)。虽然tPA有缺血脑保护作用，但tPA不宜够直接用作脑保护药物。因为tPA得丝氨酸蛋白酶结构域(P)会增大缺血脑损伤。早期有人使用蛋丝氨酸蛋白酶切位点突变的S478A-tPA，证实tPA脑保护作用与蛋白水解酶活性无关²。Tsirka⁸的早期研究发现，tPA通过蛋白水解酶活性降解神经元细胞外基质laminin-10(α5-β1-γ1)，引起细胞损伤^9，10。Reteplase只含有Kringle2和P两个结构域，缺血后15分钟注射会产生脑保护作用。alteplase比reteplase多了一个介导脑损伤的结构域(F，活化小胶质细胞¹¹)。缺血前注射tPA不会改变BBB的开放，可能是由于tPA作为神经递质，在脑中被快速清除。tPA可以通过非蛋白酶活性活化小胶质细胞，降低TNF-α的释放，发挥脑保护作用¹¹。目前，还没有治疗缺血性脑卒中的脑保护药物获得美国FDA批准。我们首次发现kringle2在脑卒中早期具有脑保护作用，为脑卒中的治疗提供了新的备选药物。

发明内容

组织型纤溶酶原激活物环饼结构-2多肽(kringle2)，作为用于脑卒中治疗，以及脑损伤，神经退行性病治疗的备选新药。

具体实施方式

1.仪器与材料