[发明专利]一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法

摘要

本发明公开了一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法，先以树脂进行水样富集，应用纤细裸藻的彗星试验，对水中的有机污染物的遗传毒性进行研究。关键技术在于制胶过程的创新，采用第一层刮胶，然后采用传统的“三明治”制胶的方法，在第三层改用熔点较高的正常熔点胶制胶，解决了传统方法胶板易受损的缺点。对藻类彗星的裂解时间和电泳条件进行了优化研究，得到了理想图像结果。目前没有关于藻类的单细胞凝胶电泳检验水体有机污染物潜在遗传毒性的报道，将藻类用于SCGE，拓展SCGE的研究对象。

主权项

1、一种检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)水样的前处理：采集水样，静置24h后，过滤去除悬浮颗粒，通过树脂吸附柱富集，再用氮气排除水分，依次用甲醇、丙酮和二氯甲烷洗脱，洗脱液在50℃下浓缩、吹干，最后用二甲基亚砜溶解，得水样富集物，-18℃下避光保存备用；(2)细胞制备：将微藻细胞接种到步骤(1)得到的水样富集物中进行染毒，将未染毒的微藻细胞作对照；将上述染过毒的微藻细胞或未染毒的正常微藻细胞分别经离心去除液体部分，用PBS重新悬浮细胞，得到细胞悬液，离心纯化备用；(3)铺胶：(3a)以1％g/mL的正常熔点琼脂糖60～120μL在磨砂载玻片上打底，再刮去；(3b)制备第一层胶：将60～120μL 1％g/mL的正常熔点琼脂糖滴在步骤(3a)得到的载玻片上，迅速盖上盖玻片，4℃固化5～10min；(3c)制备第二层胶：向步骤(2)处理后得到的细胞中加入0.7％g/mL的低熔点琼脂糖，重悬藻泥，吹打均匀成细胞悬液，调整细胞浓度1×105～1×106个细胞/mL，取50～120μL加到第一层胶上，盖上盖玻片，4℃固化30～40min；(3d)制备第三层胶：在第二层胶上滴加50～120μL 1％g/mL的正常熔点琼脂糖，盖上盖玻片，4℃固化5～10min；(4)裂解：将步骤(3d)制备好的载玻片去掉盖玻片，浸入4℃的碱性裂解液，裂解10min～2h；(5)电泳：取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓慢注入碱性电泳液，静置20min后开始电泳，电流200～300mA，电压18～25V，电泳时间为20min；(6)中和：用pH7.5、0.4mmol/L Tris-HCL缓冲液浸没载波片，漂洗每次15min，中和3次；(7)染色：胶上滴加50μg/mL的溴化乙啶30μL，加盖盖玻片，24h内镜检；(8)DNA损伤程度分析：用荧光显微镜在绿光激发下观察，拍照，获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的参数：尾动量和Olive尾动量，评价水体有机污染物潜在遗传毒性。