[发明专利]褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼鳔组织为材料启动原代培养，在含胎牛血清、羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、N-乙酰葡萄糖盐酸盐和对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清液的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼鳔细胞系，目前已传至第62代，其工艺科学合理，可望应用于生态毒理学研究，对海洋中存在的各种环境毒物进行污染监测和安全性评价；还可应用于鱼类病毒的分离、鉴定、体外繁殖以及病毒与宿主细胞相互作用等方面的研究。

主权项

1、一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法，首先将鲜活褐点石斑鱼暂养于浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水中消毒处理，24小时后以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下鳔组织，用磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；离心收集的鳔组织块则用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶进行预处理的25毫升培养瓶中，22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼鳔细胞长成单层后，使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。