[发明专利]褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用褐点石斑鱼鳔组织细胞建立鳔细胞系的方法——褐点石斑鱼 鳔细胞系的构建方法。

背景技术

近年来，随着各种海洋鱼类病毒性疾病大规模爆发和海洋环境污染的日益加剧， 水产养殖业损失巨大，同时，海洋中各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌 物、环境激素和内分泌干扰物等在水体中存在和在鱼体内的富集对人类健康带来了极 大的威胁，急需各种鱼类病毒疫苗，并建立海洋环境监测系统。而鱼类细胞系，特别 是海洋重要经济鱼类的各种组织细胞系，正是作为研究病毒感染途径、感染机理，研 制鱼类病毒疫苗的重要体外研究体系，也是进行环境污染监测和安全性评价的重要体 外研究模型，尽快建立多种海洋重要经济鱼类细胞系并在此基础上进行鱼类病毒学和 环境毒理学研究，是该领域的研究热点和主攻方向之一。

褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)俗称“老虎斑”，是我国重要的海水养殖 鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带海域，具有较高的经济价值。目前，还未有 建立褐点石斑鱼其鳔组织细胞系的相关报道，也没有通过鳔细胞系在病毒病和环境监 测中进行应用研究的成功报道。成功建立褐点石斑鱼鳔细胞系可望应用于生态毒理学 研究，对海洋中存在的各种环境毒物进行污染监测和安全性评价；还可应用于鱼类病 毒的分离、鉴定、体外繁殖以及病毒与宿主细胞相互作用等方面的研究，促进水产养 殖业的持续健康发展，带来巨大的经济效益。

发明内容

本发明的目的就是利用褐点石斑鱼鳔组织，提供一种褐点石斑鱼鳔细胞系的构建 技术，以弥补现有技术的不足。

本发明的构建方法：首先将鲜活褐点石斑鱼暂养于浓度均为1000单位/毫升的青 霉素和链霉素的高双抗海水中消毒处理，24小时后以75％酒精再次消毒，置于超净工 作台中解剖取下鳔组织，磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；离心收集的 鳔组织块用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基壳寡糖的pH值为7.0～7.4的 DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于使用0.01％明胶进行预处理的25毫升培养瓶 中，22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖 培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶 中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液；待褐点石斑 鱼鳔细胞长成单层后，再使用浓度为0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的 方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼鳔细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血 清和0.05‰～0.15‰比例的羧甲基壳寡糖、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。为 了促进褐点石斑鱼鳔细胞的分裂和快速增殖，本发明又添加了0.01‰～0.02‰的人碱性 成纤维细胞生长因子、0.02‰～0.04‰的I型人胰岛素样生长因子和0.05‰～0.15‰的N- 乙酰葡萄糖盐酸盐。为了建立褐点石斑鱼鳔细胞的最佳增殖条件，本发明在上述专用 培养液的基础上又添加了10％-20％的已抽滤的对数期褐点石斑鱼心脏细胞培养上清 液。

本发明构建的主要特点是：细胞系可以连续传代，因此能提供出大量的褐点石斑 鱼鳔细胞；细胞系既可作为进行环境监测和安全性评价的体外模型，又可为鱼类病毒 学等多种相关研究提供理想的体外研究，经这种方法所构建的鳔细胞系现已传至第62 代。

具体实施方式

将上述本发明的方法按照细胞系构建的细致步骤进行详述如下：

1、0.01％明胶预处理25毫升培养瓶：为了促进体外培养的褐点石斑鱼鳔细胞更好 的贴壁生长，原代培养实验前将0.01克明胶(Gibco)溶解在100毫升无钙镁的磷酸 盐缓冲液中，放置于50度水浴中15～30分钟使其溶解，0.22微米的微孔滤膜过滤除菌， 吸取1毫升明胶溶液加入25毫升培养瓶中包被培养瓶底面，室温放置1～2小时后将明 胶从培养瓶中吸出，培养瓶备用。