[发明专利]基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法

摘要

本发明公开了一种基于磁分离和固相单碱基循环延伸技术(SingleBase Circular Extension，SBCE)的单碱基差异(Single Base Difference，SBD)检测新方法。其特征在于以磁性颗粒为载体固定待检测位点的延伸引物，在Taq酶作用下将特定荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，通过包含有变性、退火和延伸的热循环反应，将模板的基因型信号放大。本发明具有简单、准确、低成本、高通量、高灵敏度的特点，并且该方法能够实现自动化运行，与传统方法相比该方法具有更高的实用性。

主权项

1. 一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法，其特征在于检测步骤为：a. 磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰，使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子，所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基；b. 设计引物的修饰：选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物，所设计的引物5’端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基，3’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补；c. 固相引物的制备：通过共价结合法，将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金-巯基、亲合素-生物素或者醛基-氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上，制备固相引物；d. 延伸反应：延伸反应的体系中包括固相延伸引物，模板DNA，与待检测相关SNP位点相对应的荧光标记的ddNTP，Mg2+、1×Taq酶缓冲液、TaqDNA聚合酶，通过95℃变性、退火，靶序列和延伸引物结合，在TaqDNA聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ddNTP将延伸在引物3’端，在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的引物上，如此若干循环后，延伸引物的3’端都将连接上荧光标记物；e. 经过若干个循环后，将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分洗涤，通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的SBD检测。