[发明专利]多年生黑麦草上三种腥黑粉菌近似种的检测方法

摘要

本发明涉及使用PCR引物检测禾本科草种多年生黑麦草(Lolium perenne L.)上小麦矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明自行设计了6套PCR引物，包括通用外套引物、内套引物、TCK和T.lolli特异引物以及T.vankyi的外套引物和特异引物。通用外套和内套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi基因组DNA或冬孢子套式扩增，进行质量检测，避免假阴性结果。TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特异引物用于菌丝基因组DNA三重特异PCR扩增，可以将三者区别开来。TCK、T.lolli和T.vankyi各自的外套引物与特异引物三重套式PCR，可以特异性检测这三种冬孢子。本方法检测快速，结果可靠，整个检测过程可在一个工作日内完成。

主权项

1.一种利用PCR引物对多年生黑麦草(Lolium perenne L.)上的小麦矮腥黑穗菌(Tilletiacontroversa Kühn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi进行检测的方法，这些引物既可以对这三种腥黑粉菌进行检测，又可以将它们区分开来，其特征在于，引物的序列和用途如下：(1)腥黑粉菌属(Tilletia)通用引物，引物序列如下：通用外套引物：IGSUF1：GGA TGC ATT CTG GGG ACG T IGSUR1：GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G通用内套引物：NIGSUF1：CAC CGC CCAAGC ACG TAC NIGSUR1：GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi的检测；(2)TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特异引物和T.vankyi的外套引物，引物序列如下：TCK的外套引物：IGSUF1/IGSUR1TCK的特异引物：LSKF：GAA GTT TCC TTC GCC LSKR：ACT TCT CTC GGA ACA TCA CTG T特异引物的扩增片段约为800bp，这两套引物用于TCK的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，T.lolli的外套引物：IGSUF1/IGSUR1T.lolli的特异引物：LSLF：GGT GGACTGACATTC GTC LSLR：CGC ATG TCC GTC GGA CCG特异引物的扩增片段约为250bp，这两套引物用于T.lolli的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，T.vankyi外套引物：unF：AAC TGT ATG GAT CAT CCA GAG C unR：GTA ATG CCA GAG GAT TGT CCTT.vankyi特异引物：LSNF：CTC TGT GAG GAT ATG CCA LSNR：GAG AAT AAC TGT TGT ATG ATG CCA特异引物的扩增片段约为550bp，这两套引物用于T.vankyi的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增；TCK、T.lolli、T.vankyi三者的特异引物，用于菌丝基因组DNA三重特异性PCR扩增，特异性检测这三种菌丝体，各自的外套引物与特异引物的三重套式PCR扩增，用于特异性检测这三种真菌的冬孢子。