[发明专利]乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法

摘要

一种乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法，属于生物技术领域，其构建是：a.获得及鉴定，产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA的制备，引物的设计与合成，nisRK基因PCR扩增、回收、与pGEM-T连接及转化，nisRK基因的鉴定。b.pW425N的构建，nisRK基因和基础载体pW425et的回收、连接及鉴定，诱导型启动子nisA基因的获得、鉴定及pW425N的构建。其方法是：a.绿色荧光蛋白gfp基因的获得及鉴定，b.重组表达载体的构建及鉴定，c.Nisin诱导表达载体对绿色荧光蛋白诱导表达功能的测定，d.重组乳酸杆菌稳定性检测。有益效果是：回避了以往该系统对宿主菌进行染色体整合的繁琐操作，简化了重组基因工程乳酸菌的构建。

主权项

1、一种乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建，其特征是：a、双组分调控元件nisRK基因的获得及鉴定(1)产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA的制备将-70℃冻存的产Nisin乳酸乳球菌接种于新鲜的MRS液体培养基中复苏，复苏后菌液涂布MRS培养平板上，37℃恒温厌氧培养过夜后挑取单个菌落接种于新鲜MRS液体培养基中进行培养，待菌体OD600值为0.6～0.8时，收集菌体，提取染色体DNA，-20℃保存备用；(2)引物的设计与合成根据GenBank登录的nisRK基因序列(GI：473019)，采用Primer 5.0分子生物学软件进行引物设计，上下游引物分别加入Xba I和Kpn I酶切位点，每条引物全长27bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成；引物序列如下：上游引物(P1)：GGG TCT AGA GGA GGT AAA GTG GTG TAT；下游引物(P2)：GCG GGT ACC TTA CTT TTT TAT TTT TAG；(3)nisRK基因PCR扩增、回收、与pGEM-T连接及转化以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板，PCR获得目的基因；采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收；回收产物与克隆载体pGEM-T通过T4DNA连接酶进行连接；连接产物转化E.coli JM109感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(200μg/mL)的培养基中筛选阳性克隆子；(4)nisRK基因的鉴定挑取阳性菌落接种于含氨苄青霉素(200μg/mL)的LB培养基中，37℃摇床培养过夜；次日收集菌体，小量制备重组阳性质粒pGEM-T::nisRK；并对其进行PCR鉴定和Xba I/Kpn I双酶切鉴定；b、乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体pW425N的构建(1)nisRK基因和基础载体pW425et的回收、连接及鉴定将pGEM-T::nisRK和基础质粒pW425et分别用Xba I/Kpn I双酶切后，回收目的片段，采用T4DNA连接酶进行连接；连接产物转化E.coli X13感受态细胞中，在含有红霉素(200μg/mL)的LB培养基中筛选阳性克隆子；小量制备重组质粒后，进行PCR鉴定和Xba I/Kpn I双酶切鉴定；结果表明，成功组建了重组质粒pW425et::nisRK；(2)诱导型启动子nisA基因的获得、鉴定及pW425N的构建根据GenBank登录的nisA序列，采用Primer 5.0分子生物学软件进行引物设计，上下游引物分别加入EcoRI和Sac I酶切位点，每条引物全长24bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列如下：上游引物(P1)：GGG GAA TTC ATT AAA TTC TGA AGT下游引物(P2)：GGG GAG CTC TTA TTT GCT TAC GTG以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板，PCR获得目的基因；采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收；回收产物与pW425et::nisRK分别用EcoR I/Sac I进行双酶切，将回收目的产物采用T4DNA连接酶进行连接，再转化E.coli X13感受态细胞中，在含有红霉素(200μg/mL)的LB培养基中筛选阳性克隆子；小量制备重组质粒，对其进行PCR鉴定和EcoRI/SacI双酶切鉴定；结果表明，获得的诱导型启动子nisA与已知序列同源性高达100％，并用其成功替换了原组成型启动子P32，构建了乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体pW425N。