[发明专利]新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建

摘要

一种新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建，属于生物技术领域，其特征是：1.新城疫病毒F48E9株HN基因和F基因的克隆与序列分析，2.新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN和pW425et-F的构建及在大肠杆菌中的表达，3.重组质粒pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌中的表达。有益效果是：外源基因F和HN在乳酸菌中获得了表达，并且具用反应原性，而且重组基因工程乳酸菌可以增强机体对新城疫病毒的粘膜免疫。利用这一平台也可将其它引起禽类高度接触性传染病的病原微生物的保护性抗原基因转入益生的乳酸菌中，使其表达。

主权项

1、一种新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建，其特征是：a、新城疫病毒F48E9株HN基因和F基因的克隆与序列分析根据Genebank中NDV F48E9株的HN基因序列和F基因序列，分别设计出带有SacI和KpnI酶切位点的一对引物，应用RT-PCR方法扩增出HN基因和F基因，并将其克隆至pMD-18T载体中，进行核苷酸序列分析；b、新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN和pW425et-F的构建及在大肠杆菌中的表达SacI和KpnI双酶切重组质粒pMD18-T-HN和pMD18-T-F，将纯化的HN基因和F基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中，构建出可以在大肠杆菌与乳酸菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-HN和pW425et-F；将pW425et-HN和pW425et-F分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态X13中，经过生长功能弥补筛选阳性克隆，经SDS-PAGE分析，可见约66kD的融合蛋白和59kD的融合蛋白；这与根据核苷酸大小计算的蛋白及融合蛋白之和的大小相符，说明外源片段插入正确表达成功；Western-blot分析表明，融合蛋白能与NDV阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有较好的抗原性，从而为pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌受体菌株中的表达提供实验基础；c、重组质粒pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌中的表达应用电转化技术将已构建的新城疫病毒重组质粒pW425et-HN和pW425et-F分别转化至嗜酸乳杆菌感受态中；对筛选到的阳性克隆，采用SDS-PAGE进行鉴定，可见约66kD的融合蛋白和59kD的融合蛋白。