[发明专利]肝芽干细胞及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及肝芽干细胞，及其制备方法和用途。近年来干细胞生物学得到了迅猛的发展。肝干/祖细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育、肝脏肿瘤和肝脏再生的发生机理以及多种肝脏疾病的防治都具有十分重要的价值。目前成功培养的肝干/祖细胞系是十分有限的。本发明是从孕4.5～6周的人胚肝芽组织中分离到的一种多潜能的干细胞，对于肝脏发育与再生等相关医学问题的认识具有重要意义，并为肝干细胞生物学的研究提供一个理想的细胞模型，也有可能为各种因素所致肝脏疾病的细胞治疗、药物的筛选、组织工程等多个领域的研究提供一种理想的细胞来源。

主权项

1.一种从人胚肝芽组织中分离培养肝芽干细胞的方法，其特征在于该方法是由以下步骤组成的：A、原代培养物的建立：取胎龄4.5至6周的流产人胚胎，以PBS充分洗涤后在解剖显微镜下分离出完整的胚胎肝脏，置于96孔板内以0.05％ Trypsin/EDTA消化约2-8分钟，然后加入改良IF培养液终止消化，静置后取悬液，置于铺有0.2％明胶的培养皿内，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养；待3-4小时细胞贴壁后换液，以后隔天换液，每次均以PBS洗涤2-3次；改良IF培养液是以IMDM培养基：HAM F12培养基＝1:1为基础培养基，添加2.5％胎牛血清、5μg/ml胰岛素、20ng/ml表皮细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1mM GlutamaxTM和1％青/链霉素配制而成；B、细胞传代培养：在原代培养物生长两周以后，一种小三角形细胞出现优势克隆样生长，以无菌细胞刮去除其他形态的细胞，PBS充分洗涤后，用0.05％Trypsin/EDTA消化至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，计数后以1×104/cm2的密度接种至另一铺有0.2％明胶的培养瓶/皿中继续培养；每4～5天传代一次；C、培养细胞的冻存与复苏：a)细胞的消化与冻存：细胞长至约90％汇合时，PBS充分洗涤，用0.05％Trypsin/EDTA消化，至大部分细胞形态变圆，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，1000r.p.m离心6分钟，弃去上清液，以107个细胞/ml的比例加入冻存液，充分混匀后置于冻存管中密封，先置于4℃30-60分钟，后置于-70℃ 10-14小时，最后置于液氮罐中保存；冻存液是以冻存原液和步骤A中配制的改良IF培养液各一份混匀而成，冻存原液是以改良IF培养液:胎牛血清:二甲亚砜＝3:1:1配制而成；b)冻存细胞的复苏：将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴箱中解冻；1000r.p.m离心6分钟，弃去冻存液，置于铺有0.2％明胶的培养皿中，加入改良IF培养液，37℃、5％ CO2、95％湿度条件培养。