[发明专利]一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法

摘要

本发明涉及一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，属植物种苗繁殖技术领域，专用于浙贝母脱毒苗的繁殖与病毒的检测。该方法包括：培养基的配制；脱毒组培鳞茎的培养；病毒ELISA检测等步骤。具有脱毒效果好，病毒检测灵敏度高，可保证脱毒子鳞茎中无病毒存在，有效控制了病毒病的发生与传播；鳞茎增殖快，月增殖率可达4.5倍，适合工厂化育苗，大大节省了传统方法的繁种用地，显著降低了浙贝母的生产成本；可在浙贝母品种提纯复壮与开发中推广应用。

主权项

1.一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2 MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；2)子鳞茎诱导培养基：MS+2，4-D 0.5～1.5mg/L+ZT 1～3mg/L；3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 1～3mg/L+NAA 1～3mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；4)壮苗培养基：MS+BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.5～1.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；5)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.1～1mg/L+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；6)鳞茎生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养：1)外植体的选取、培育与处理：①取浙贝母新生长的鳞茎、嫩茎或花梗，经灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；②子鳞茎诱导培养：将外植体材料在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；③子鳞茎增殖培养：将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；④壮苗培养：将增殖的子鳞茎在4℃低温、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理1周，然后在培养条件下培养30～45天长成苗高5～7cm的壮苗；⑤热处理：将壮苗在35℃、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理2～4周后，供茎尖培养用；⑥茎尖培养：将热处理后的组培壮苗在解剖镜下，摘出0.2～0.5mm长带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；2)子鳞茎诱导培养：将外植体茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；3)子鳞茎增殖培养：将子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；4)子鳞茎生长培养：将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天，使鳞茎长大到0.5～1cm；5)生根培养：将长大的子鳞茎接种在生根培养基上，在培养条件下培养20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出3～5根根系；6)移栽：待生根子鳞茎苗高生长至5～7cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗。(3)、病毒ELISA检测：将田间病株所携带的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaicVirus，TFMV)和贝母Y病毒(Fritillary virus Y，FVY)，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备成病毒特异性抗血清后，对浙贝母脱毒组培鳞茎进行病毒ELISA检测。