[发明专利]一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法。

背景技术

浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)是百合科贝母属植物，其干燥鳞茎是著名中药材“浙八味”之一，是化痰止咳、治疗气管炎、感冒等呼吸道疾病的常用良药。浙贝母原产象山县，故又称象贝母。据传清康熙年间，象山农民开始将贝母从野生转入家种。一直以来，浙贝母以磐安、鄞州为主产地，约占全国浙贝母总产量的70％，江苏、江西、上海、湖北和湖南省亦有栽培。随着种植业结构调整的深入，近年来浙江省浙贝母的栽培面积迅速扩大。

但在人工栽培中，浙贝母生产由于采用大鳞茎作种，其繁殖系数极低，约为1.6～1.8倍，用种量极大，用种500kg/亩，种子地下休眠期长，约4个月。浙贝母如此低的繁殖系数和如此高的耗种量，导致生产用地和留种地面积的增加及生产成本增加。同时，长期的营养繁殖导致浙贝母种质严重退化，鳞茎产量和品质下降，已成为严重地阻碍了浙贝母产业的发展的重要问题之一。近年来的研究揭示，植物病毒的侵染也是引起浙贝母种质退化的主要原因之一。最近我们在浙江磐安县田间对浙贝母进行调查发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等典型的马铃薯Y病毒科成员侵染症状。通过对该病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全序列的研究，结果表明存在二种新病毒的复合侵染，一种是浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic Virus，TFMV)，另一种命名为贝母Y病毒(Fritillary virus Y，FVY)，该病毒病害普遍发生是引起浙贝母种质严重退化的重要原因之一；同时提出以田间浙贝母上发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达制备成病毒特异性抗血清，对浙贝母植株样品进行病毒ELISA检测的方法(Wei CB et al.(2005)Archives of Virology，150：1271-1280；Chen J et al.(2006)Archives of Virology，151：439-447；韦传宝等(2006).科技通报，22(4)：506-509)。浙贝母茎尖脱毒组培培养研究到目前为止尚未见报道。因此建立浙贝母脱毒组培快繁技术体系，生产优质无病毒种球，为真正实现GAP栽培和规模化生产提供技术平台，具有较大的应用前景。

发明内容

本发明目的是，针对现有浙贝母常规生产繁种技术中采用大鳞茎作种，繁殖系数极低，用种量极大，种子地下休眠期长，生产和留种地面积大，并有植物病毒侵染，导致品质差，产量低，生产成本高等缺陷；  提供一种能大量、快速繁殖鳞茎，又能脱除鳞茎所带病毒并经特异检测，以确保无毒的浙贝母鳞茎脱毒、组培与检测的配套方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2 MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

2)子鳞茎诱导培养基：MS+2，4-D 0.5～1.5mg/L+ZT 1～3mg/L；

3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 1～3mg/L+NAA 1～3mg/L+盐酸硫胺素(VB₁)4mg/L：

4)壮苗培养基：MS+BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.5～1.5mg/L+盐酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

5)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.1～1mg/L+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素(VB₁)4mg/L+水解酪蛋白(CH)500mg/L；

6)鳞茎生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素(VB₁)4mg/L；

(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养：

1)外植体的选取、培育与处理：

①取浙贝母新生长的鳞茎、嫩茎或花梗，经灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；

②子鳞茎诱导培养：将外植体材料在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；

③子鳞茎增殖培养：将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；