[发明专利]一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法

权利要求书

1.一种浙贝母脱毒组培鳞茎的培养方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2 MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH 5.6～5.8；

2)子鳞茎诱导培养基：MS+2，4-D 0.5～1.5mg/L+ZT 1～3mg/L；

3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 1～3mg/L+NAA 1～3mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；

4)壮苗培养基：MS+BA 0.5～1.5mg/L+NAA 0.5～1.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；

5)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.1～1mg/L+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；

6)鳞茎生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；

(2)浙贝母脱毒组培鳞茎的培养：

1)外植体的选取、培育与处理：

①取浙贝母新生长的鳞茎、嫩茎或花梗，经灭菌处理，作为摘取脱毒组培用外植体的材料；

②子鳞茎诱导培养：将外植体材料在无菌条件下，切成0.3～0.6cm的切段，接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；

③子鳞茎增殖培养：将诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；

④壮苗培养：将增殖的子鳞茎在4℃低温、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理1周，然后在培养条件下培养30～45天长成苗高5～7cm的壮苗；

⑤热处理：将壮苗在35℃、光强2000～3000Lx，光照时间12h/d下处理2～4周后，供茎尖培养用；

⑥茎尖培养：将热处理后的组培壮苗在解剖镜下，摘出0.2～0.5mm长带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒培养的外植体；

2)子鳞茎诱导培养：将外植体茎尖接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月后，诱导形成子鳞茎；

3)子鳞茎增殖培养：将子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；

4)子鳞茎生长培养：将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天，使鳞茎长大到0.5～1cm；

5)生根培养：将长大的子鳞茎接种在生根培养基上，在培养条件下培养20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出3～5根根系；

6)移栽：待生根子鳞茎苗高生长至5～7cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗。

(3)、病毒ELISA检测：

将田间病株所携带的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaicVirus，TFMV)和贝母Y病毒(Fritillary virus Y，FVY)，经扩增、克隆和原核表达后，所获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备成病毒特异性抗血清后，对浙贝母脱毒组培鳞茎进行病毒ELISA检测。

2.按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖、壮苗及鳞茎生长培养基用MS培养基；鳞茎生根培养基用1/2MS培养基；其中，琼脂7g/L，pH5.8；

(2)子鳞茎诱导培养基：蔗糖30g/L的MS+2，4-D 1mg/L+ZT 2mg/L；

(3)子鳞茎增殖培养基：白糖40g/L的MS+BA 2mg/L+NAA 2mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；

(4)壮苗培养基：白糖40g/L的MS+BA 1mg/L+NAA 1mg/L+盐酸硫胺素4mg/L；

(5)鳞茎生长培养基：白糖40g/L的MS+BA 0.5mg/L和NAA 0.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L+水解酪蛋白500mg/L；

(6)生根培养基：白糖20g/L的1/2MS+NAA 0.5mg/L+盐酸硫胺素4mg/L。