[发明专利]一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法

摘要

本发明属于微生物工程领域，涉及一种从高盐环境微生物中高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的方法。特点是采集典型的高盐环境土壤样品，通过粗提和纯化获得土壤样品的宏基因组DNA，然后用宏基因组DNA部分酶切片段与载体之间的连接产物电激转化大肠杆菌缺陷株K，通过筛选获得阳性克隆，并对阳性克隆携带的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因进行功能鉴定。本发明可以规模化克隆微生物来源的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，用于构建转基因耐盐作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。

主权项

1.一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序、目的基因的亚克隆和再转化操作，获得Na+/H+逆向转运蛋白单一基因或者基因簇，并对目的基因进行功能鉴定，其特征是土壤样品来自高盐环境，样品采集后保存温度为-70℃--80℃；提取宏基因组DNA的详细步骤为：(1)称取1g土样于15mL离心管中，加入2-10mL经过35-37℃预热的DNA提取液和50-200mgPVPP及10-100μL溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min，加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS，10-100μL溶菌酶-合20-200个活性单位；DNA提取液的配方包括：100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，浓度为1-3％CTAB，pH7.8-8.2；(2)50-65℃水浴1-2小时，每隔10-30min上下颠倒离心管；水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min，5-50μL蛋白酶K-合10-100个活性单位；(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；0-10℃、8000-12 000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2小时，然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；重复冷冻和融化1次，0-10℃、8000-12 000r/min离心5-20min，得到上清2；将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；(5)抽提：向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇，氯仿与异戊醇体积比为24∶1，上下颠倒离心管，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清4；吸取上清液4至另一离心管，加入体积相当于上清液4的0.1倍的预冷的pH＝5.2的1mM EDTA-3M NaAc和体积相当于上清液4的0.6倍的预冷的异丙醇，混匀后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小时使DNA沉淀；0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL经0-10℃预冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用；对于大量提取宏基因组DNA，则土样的称取数量和相应试剂的用量要按比例增加。