[发明专利]一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物工程领域，涉及一种高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的方法。

背景技术：

在国际上，大肠杆菌缺陷株K被用来从微生物中克隆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因。其通常做法是：提取纯培养微生物的基因组DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，将酶切片段连接到载体，并用连接产物转化大肠杆菌缺陷株K。然后，在含一定浓度NaCl或LiCl的固体培养基上对转化子进行筛选，从而获得携带Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的重组子。采用上述方法，已经从微生物中克隆得到了10余种类型的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，并对其中部分基因的功能特性进行了研究。由于环境中99％以上的微生物无法通过现有方法得到纯培养，因此，利用已有技术获得微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的数量有限，极大地限制了对微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的挖掘和利用。为了加速对微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白功能基因资源的认识和挖掘，需要发展高通量的目的基因筛选方法。

发明内容：

本发明的目的是从环境微生物中高通量、规模化克隆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因资源，用于深入研究微生物输出钠离子的分子机制，以及构建转基因耐盐作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。

一种高通量克隆微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序和目的基因的亚克隆与再转化，获得Na⁺/H⁺逆向转运蛋白单一基因或基因簇，并对基因进行功能鉴定。其特征是：

1.样品采集

从盐湖、盐碱湖和盐碱地等多元化的地域环境中采集土壤样品，样品采集后，-70℃--80℃保存备用。

2.采用CTAB-SDS-冻融法粗提宏基因组DNA

宏基因组DNA是指特定环境样品中所有微小生物的DNA总和。CTAB-SDS-冻融法(即十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠-冻融法)粗提宏基因组DNA的详细步骤为：

(1)称取1g土样于15mL离心管中(如果需要大量提取宏基因组DNA，可称取3-10g土样于50mL离心管中，相应试剂的用量按比例增加)，加入2-10mL经35-37℃预热的DNA提取液、50-200mg PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)、10-100μL(约20-200个活性单位)溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min。然后加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS(十二烷基硫酸钠)，上下用力颠倒，使之混匀；

DNA提取液的配方包括：100mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/LNa3 PO4(磷酸三钠)，1.5mol/LNaCl，浓度为1-3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，pH7.8-8.2。

(2)50-65℃水浴1-2小时(每隔10-30min上下轻轻颠倒离心管2-4次，切勿振荡！！)。水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL(约10-100个活性单位)蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min；

(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；0-10℃、8000-12000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；

(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2小时。然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；

再冷冻和融化各1次，0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清2；

将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；