[发明专利]产1,3－丙二醇氧化还原酶的工程菌及其酶制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，其采用PCR技术克隆来自克雷伯肺炎杆菌DSM 2026的dhaT基因，构建含dhaT基因的大肠杆菌表达载体pET－dhaT，转化至大肠杆菌DH5α中进行质粒复制，抽提的重组质粒再转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得了能表达1，3－丙二醇氧化还原酶(PDOR)的重组基因工程菌株E.coli－pET－dhaT，经验证，该重组菌在无抗生素选择压力下，仍能稳定的大量生产PDOR；采用乳糖代替IPTG作为诱导剂，在合适的培养条件，获得的PDOR比活达25.5U/mg。

主权项

1、一种产PDOR的基因工程菌，其特征是： A、材料克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae DSM 2026)，E.coli BL21(DE3)，pMD18-T，质粒pET-15b，上述材料在尊重保护知识产权的情况下均方便获得或购得；B、生产PDOR工程菌的构建用煮沸法从Klebsiella pneumoniae DSM 2026菌株上提取总DNA；以5’-GGCCCATATGAGCTATCGTATGTTTGATTATC-3’为前引；5’-ACTTGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3’为后引；采用PCR扩增得到目的基因dhaT，1％琼脂糖电泳分离，切胶回收；参照美国Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版的基因插入方法，将目的基因dhaT插入pMD18-T，得到重组质粒pMD-dhaT，再将pMD-dhaT和pET-15b分别用Nde I和BamH I酶切，按照T4 DNA Ligation(Biolab)的说明书设计连接体系，并进行粘端连接，连接产物转化至用CaCl2法制备的感受态BL21(DE3)；用100μg/mL氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB平板培养，37℃过夜，挑取8-10个菌落，用含75μg/ml Amp的LB培养基进行增菌培养3-12h(37℃，250rpm)，用质粒抽提试剂盒(Omega)提取质粒，用Nde I和BamH I进行双酶切鉴定，选择一个含阳性重组质粒pET-dhaT的菌株，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-dhaT，也即一种产1，3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌。